杜仲中環(huán)烯醚類化合物的固相分離

杜仲中環(huán)烯醚類化合物的固相分離

杜仲是中國傳統(tǒng)的名藥，具有調(diào)理肝郁壓、增強(qiáng)免疫功能、抗癌、疲勞等功效。藥理研究表明,杜仲中的京尼平苷、京尼平苷酸等環(huán)烯醚萜類化合物是主要的降血壓活性成分,而其中的桃葉珊瑚苷卻具有升高血壓的作用。因此,將杜仲中京尼平苷、京尼平苷酸與桃葉珊瑚苷分離十分有應(yīng)用價值。固相萃取技術(shù)是一個包含液相和固相的物理過程,在藥物、環(huán)境、農(nóng)藥等的分析中常作為一種預(yù)處理手段,具有分離純化效率高、操作簡便、溶劑耗量少等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用以未鍵合的硅膠為填料進(jìn)行固相萃取,以不同極性的溶劑萃取分離純化杜仲中的環(huán)烯醚萜類化合物,所得產(chǎn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)高,易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。1對照品及合成試劑日本島津2010A高效液相色譜儀;SPD—M10AVP檢測器;甲醇為色譜純;高效液相色譜所用水為石英亞沸水;其他試劑均為分析純;京尼平苷對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、京尼平苷酸對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),日本和光純藥工業(yè)株式會社提供;硅膠(100~140目),青島海洋化工廠;杜仲藥材購于湖南張家界,經(jīng)筆者鑒定為杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮。2方法和結(jié)果2.1京尼平酸和京尼平酸的hplc試驗(yàn)2.1.1流動相甲醇-水-冰醋酸柱的測定VP-ODS反相C18柱(150mm×4.6mm),預(yù)柱(10mm×4.6mm),流動相甲醇-水-冰醋酸(20∶79.5∶0.5),體積流量1.0mL/min,測定波長237nm,進(jìn)樣量10μL,柱溫25℃。2.1.2京尼平苷酸的線性范圍以對照品溶液質(zhì)量濃度(X)對色譜峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明,京尼平苷在5.1~20.4μg/mL,京尼平苷酸在4.0~16.0μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。線性回歸方程分別為京尼平苷:Y=33314.5+13026.1X,r=0.9995;京尼平苷酸Y=23114.0+27273.8X,r=0.9999。2.1.3測量用峰高增加法定性,標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。2.2淋洗、干燥和活化先用甲醇浸泡12h,甲醇具有凈化和活化硅膠的雙重作用。然后用甲醇淋洗以除去硅膠中的雜質(zhì)和惰性溶劑,再用大量蒸餾水淋洗,以除去硅膠中殘留的甲醇,最后把硅膠置于干燥爐里,于120℃干燥活化24h。2.3京尼平苷的提取精確稱取干燥杜仲粗粉8g于索氏提取器中,加入80mL60%乙醇,在50℃恒溫水浴鍋中提取2h,提取次數(shù)為3次,濾過,合并濾液,減壓蒸餾,濃縮至約10mL,20mL石油醚萃取3次,石油醚萃余液用20mL醋酸乙酯萃取3次,醋酸乙酯萃余液再用20mL正丁醇萃取3次。合并正丁醇萃取液,減壓蒸餾,回收正丁醇,并蒸至近干,所得膏狀物用40mL甲醇溶解完全后,轉(zhuǎn)移入200mL燒杯中,加入24g處理后的硅膠,在60℃水浴中加熱,揮發(fā)除去甲醇,加熱時不停攪拌(防止受熱不均,硅膠濺出)。將上述硅膠干法裝入底部已鋪玻璃纖維(防止硅膠隨溶液流出)的500mL分液漏斗中,用不同配比的氯仿-甲醇溶液作萃取劑,高效液相色譜法跟蹤指標(biāo)成分。先加入萃取液(14∶1)80mL,充分振蕩,放出萃取液,重復(fù)操作2次。再依次加入萃取液(11∶1、9∶1、6∶1)重復(fù)上述操作。合并萃取液(11∶1),減壓蒸餾,得京尼平苷粗品,冷凍干燥,HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.86%。合并萃取液(6∶1),減壓蒸餾,得京尼平苷酸粗品,冷凍干燥,HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63.73%。2.4京尼平苷的提取將京尼平苷粗品用20mL甲醇溶解完全后,轉(zhuǎn)移入200mL燒杯中,加入30g處理后的硅膠,其余操作與2.3項(xiàng)下方法相同,先采用氯仿-甲醇(14∶1)萃取液80mL萃取,再用萃取液(11∶1)80mL萃取,重復(fù)操作2次,合并萃取液(11∶1),減壓蒸餾蒸至近干。用10mL甲醇溶解完全后,重結(jié)晶,得京尼平苷精品,HPLC測其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.09%。將京尼平苷酸粗品用20mL甲醇溶解完全后,轉(zhuǎn)移入200mL燒杯中,加入30g處理后的硅膠,其余操作與2.3項(xiàng)中相同,先采用氯仿-甲醇(9∶1)萃取液80mL萃取,再用萃取液(6∶1)80mL萃取,重復(fù)操作2次,合并萃取液(6∶1),減壓蒸餾蒸至近干。用10mL甲醇溶解完全后,重結(jié)晶,得京尼平苷酸精品,HPLC測定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.74%。2.5吸附劑用量與原料配比的關(guān)系在吸附過程中,吸附劑的用量是一個非常重要的參數(shù)。吸附劑用量直接影響到吸附是否完全、吸附劑的利用率和分離的效果。本實(shí)驗(yàn)考察了硅膠用量與京尼平苷、京尼平苷酸收率的關(guān)系,見表1?？芍?在吸附劑用量與原料比達(dá)到3∶1時,京尼平苷和京尼平苷酸的收率均較高,分別達(dá)到了69.45%和67.52%。繼續(xù)增大吸附劑用量,收率沒有顯著提高,且增加了成本;較低的吸附劑用量又會導(dǎo)致收率的降低,所以選擇吸附劑用量與原料質(zhì)量的比例為3∶1。2.6萃取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)對成分萃取率的影響采用固相萃取小柱進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)選擇萃取劑時,考慮到實(shí)驗(yàn)的簡便,采用氯仿-甲醇溶液。因氯仿和甲醇的配比不同,混合溶液的極性呈梯度變化,分別萃取出不同極性的物質(zhì)。不同配比氯仿-甲醇溶液對環(huán)烯醚萜類化合物進(jìn)行萃取,萃取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)對成分萃取率的曲線關(guān)系見圖1?？芍?當(dāng)萃取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)為6.67%,即氯仿-甲醇(14∶1)時,京尼平苷開始被萃取出,但量較少,至甲醇體積分?jǐn)?shù)為9.09%,即氯仿-甲醇(10∶1)時,京尼平苷全部被萃取下來。當(dāng)萃取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)為11.11%,即氯仿-甲醇(9∶1)時,京尼平苷酸開始被萃取出,至甲醇體積分?jǐn)?shù)為20.00%,即氯仿-甲醇(5∶1)時,京尼平苷酸全部被萃取下來?？紤]到溶劑的消耗和萃取組分的純度,京尼平苷粗品收集配比為13∶1、12∶1、11∶1的萃取液,京尼平苷酸粗品收集配比為8∶1、7∶1、6∶1的萃取液,萃取率分別達(dá)到92.51%和92.48%。2.7京尼平苷和京尼平苷酸提取液的制備精確稱取40g杜仲樣品,提取,減壓蒸鎦,濃縮提取液,定容至50mL。移取10mL,稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度,測定提取液中京尼平苷和京尼平苷酸的量。其余取4份10mL濃縮液,制備得京尼平苷和京尼平苷酸精品,測定,計算回收率,結(jié)果見表2。3固相萃取分離技術(shù)回收試驗(yàn)中有一部分京尼平苷和京尼平苷酸在制備過程中損失了,其原因可能是硅膠上的不可逆吸附;有機(jī)溶劑萃取的不完全;重結(jié)