erkmapk信號(hào)傳導(dǎo)通路異常激活與鼻咽癌細(xì)胞增殖凋亡的關(guān)系

erkmapk信號(hào)傳導(dǎo)通路異常激活與鼻咽癌細(xì)胞增殖凋亡的關(guān)系

絲綢原激活蛋白激酶（migen-a活潑蛋白激酶（mgk））是真核細(xì)胞中的一個(gè)重要的信號(hào)調(diào)導(dǎo)系統(tǒng)。屬于絲氨酸酪氨酸酶，可由多種刺激（如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)纖維等）激活。激活后，可以激活核內(nèi)的各種基因（如編碼因子、其他蛋白激酶等），以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，并參與各種生理過程，如細(xì)胞分裂、復(fù)制、移動(dòng)和死亡。目前,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)MAPK通路中4個(gè)亞家族,即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signalregulatedproteinkinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Junamino-terminalkinase,JNK/SAPK)、p38MAPK和ERK5/BMK1(bigMAPkinase1)。ERK1/2信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)。本研究通過檢測(cè)p-ERK、CyclinD1和Ki-67在鼻咽癌及鼻咽黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)的意義和關(guān)系以及ERK信號(hào)通路阻滯劑PD98059對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的影響,探討ERK/MAPK信號(hào)通路與鼻咽癌細(xì)胞增殖凋亡的關(guān)系,以期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌治療的新途徑。1材料和方法1.1肺癌病例選擇選擇36例鼻咽癌標(biāo)本和42例鼻咽黏膜慢性炎均取自人民解放軍第四二二醫(yī)院病理科2004-01-2007-12存檔蠟塊。鼻咽癌患者中,男28例,女8例。年齡24～76歲,中位年齡50歲。所有病例就診前均未行放療或化療。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定,常規(guī)制片。人低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞系為廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室保存。1.2免疫組織化學(xué)試劑小鼠抗人磷酸化ERK及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)用CyclinD1單克隆抗體為美國(guó)SantaCruz公司產(chǎn)品?？剐∈驣gG(HRP)二抗、兔抗人CyclinD1、Ki-67單克隆抗體及免疫組織化學(xué)試劑均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。每一批實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照用已知陽(yáng)性組織切片,陰性對(duì)照用PBS代替一抗。PD98059購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所,母液質(zhì)量濃度為20mg/mL。1.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)設(shè)立不同對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,按SP法試劑盒操作說明分別檢測(cè)石蠟標(biāo)本和細(xì)胞爬片標(biāo)本中p-ERK、CyclinD1和Ki-67蛋白的表達(dá)。1.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)設(shè)立對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別用10、50和100μmol/L濃度的ERK信號(hào)通路阻滯劑PD98059處理CNE-2Z細(xì)胞,HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,Hoechst33342/PI熒光雙染法觀察細(xì)胞的凋亡,蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)CyclinD1基因的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)p-ERK、CyclinD1和Ki-67蛋白的表達(dá)。1.5細(xì)胞顯色分級(jí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙盲法評(píng)估,綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量積分,按半定量方法判斷。1)按顯色深淺評(píng)分:0分為不顯色,1分為淺黃色顯色,2分為棕黃色顯色,3分為棕褐色顯色。2)按顯色比例評(píng)分:顯色細(xì)胞數(shù)≤5%為0分;>5%～25%為1分;>25%～50%為2分;>50%～75%為3分;>75%為4分。以上述2項(xiàng)乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn):0分為(-),1～2分為(+),3～4分為(++),>5分為(+++)。p-ERK、Ki-67和CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)定位于胞核。1.6統(tǒng)計(jì)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0做四格表χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1鼻模擬的皮細(xì)胞p-ERK、CyclinD1和Ki-67蛋白在鼻咽癌細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.44%(25/36)、80.56%(29/36)和80.56%(29/36),在鼻咽黏膜上皮細(xì)胞分別為23.80%(10/42)、19.05%(8/42)和9.52%(4/42),兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01(圖1)。2.2yclind、ki-97蛋白表達(dá)36例鼻咽癌組織中,p-ERK與CyclinD1、Ki-67蛋白表達(dá)呈正相關(guān),r值分別為0.604和0.668,P<0.01(表1)。2.3細(xì)胞水腫、胞膜破裂10、50和100μmol/LPD98059處理CNE-2Z細(xì)胞6h可觀察到細(xì)胞腫脹,邊界不清;24h見細(xì)胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞不同程度的皺縮變圓,折光性差,核染色質(zhì)邊集,部分細(xì)胞胞膜破裂。細(xì)胞碎片隨藥物濃度增加,呈現(xiàn)上述形態(tài)改變的細(xì)胞數(shù)量增加。2.4pahs對(duì)cne-2z細(xì)胞ki-97的表達(dá)的影響免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)顯示,CNE-2Z細(xì)胞空白對(duì)照組中p-ERK、CyclinD1和Ki-67均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。不同濃度PD98059分別作用于CNE-2Z細(xì)胞24h后,可見p-ERK、CyclinD1和Ki-67的表達(dá)下降(圖2)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示,10、50和100μmol/LPD98059分別處理鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞24h后,CyclinD1蛋白的表達(dá)量均減少,并呈現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)。2.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)50和100μmol/LPD98059分別處理鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞24h后,Hoechst33342/PI熒光雙染可以觀察到細(xì)胞凋亡(圖3);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到凋亡峰。3pd9820059對(duì)肺癌中p-erk、cyclin1和ki-66表達(dá)的影響ERK1/2信號(hào)通路的活化是將信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)的關(guān)鍵,參與這一轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的有GTPase、Ras、Raf-1和MEK1/2雙特異性激酶等。ERK1/2信號(hào)通路是由一個(gè)小GTP蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞質(zhì)蛋白組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng),其活化的中心是使Ras進(jìn)行鳥氨酸交換變成其活化形式Ras-GTP,并需要Ras和Raf-1蛋白參與,ERK1/2位于胞質(zhì)內(nèi),可被各種生長(zhǎng)因子等有絲分裂原激活,激活的ERK1/2迅速穿過核膜顯著地聚積于核內(nèi),并通過磷酸化反應(yīng)作用于c-Jun、NF-AT、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)一步調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄,引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變,最終調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和功能,并影響細(xì)胞產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)。p-ERK即磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶,是ERK的活性形式,它可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),通過磷酸化活化轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)控特定基因的表達(dá)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,當(dāng)阻斷ERK1/2入核時(shí),轉(zhuǎn)錄因子Elk-1的磷酸化也被阻斷,相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了ERK的活化形式,即p-ERK蛋白的表達(dá)。在36例鼻咽癌組織中,有p-ERK蛋白高表達(dá),而對(duì)照鼻咽黏膜上皮中p-ERK僅少數(shù)表達(dá)陽(yáng)性,提示鼻咽癌的發(fā)生中存在ERK通路的持續(xù)激活,且ERK的高活性狀態(tài)可能在鼻咽癌的進(jìn)展中起一定的作用。CyclinD1是參與細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換的重要正性調(diào)節(jié)蛋白,有研究表明,CyclinD1可能是鼻咽癌細(xì)胞G1/S期行進(jìn)中必不可少的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子。Ki-67是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志,有研究表明Ki-67與鼻咽癌細(xì)胞增殖和患者的預(yù)后關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,36例鼻咽癌中CyclinD1、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率均為80.56%,且與p-ERK表達(dá)呈正相關(guān),提示ERK信號(hào)通路激活其下游基因CyclinD1和Ki-67,Ki-67協(xié)同CyclinD1共同導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂,促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖。PD98059可結(jié)合胞質(zhì)中未磷酸化的MEK1ATP位點(diǎn),特異性阻斷ERK上游分子MEK1對(duì)ERK的磷酸化活化作用,對(duì)胞質(zhì)中總ERK蛋白水平并無影響,體外實(shí)驗(yàn)可明顯抑制細(xì)胞株癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用低、中、高濃度(10、50和100μmol/L)的PD98059處理鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞24h后,免疫細(xì)化顯示不同濃度PD98059均可降低CNE-2Z細(xì)胞中p-ERK、CyclinD1和Ki-67蛋白的表達(dá);50和100μmol/L的PD98059處理后,熒光雙染可觀察到凋亡細(xì)