恩度對hne-1細胞血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的影響

恩度對hne-1細胞血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的影響

近年來，通過對腫瘤血管形成的研究，一些惡性的腫瘤細胞能夠模擬形成血管樣本結(jié)構(gòu)。腫瘤血管模擬現(xiàn)象（mv）是指從腫瘤中連接到內(nèi)皮細胞的短暫通道，并以細胞外基質(zhì)分離的微生物管道。此外,腫瘤細胞能與內(nèi)皮細胞共同形成馬賽克樣血管(mosaiccelltypesoftumorbloodvessel),使腫瘤血管壁的均一性、彈性和通透性與正常血管不同。腫瘤的這種生物學特性有利于腫瘤細胞的快速生長和轉(zhuǎn)移。本研究以人鼻咽低分化鱗癌HNE-1細胞株為對象,觀察其形成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的過程和結(jié)構(gòu)特點,并研究新型重組人血管內(nèi)皮抑制素(rh-Endostatin,Endostar,恩度)對鼻咽癌細胞增殖、遷移和體外血管生成擬態(tài)的影響。1mtt法檢測細胞遷移和體外管道形成實驗1.1主要材料人鼻咽低分化鱗癌HNE-1細胞系,中南大學腫瘤研究所提供;人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)CRL-1730細胞系,汕頭大學醫(yī)學院張澤文老師惠贈。新生牛血清購自武漢三利生物制品廠,DMEM培養(yǎng)液為Gibico產(chǎn)品,胰蛋白酶購自Sigma公司,人工基質(zhì)Matrigel購自美國BectonDickinson公司,重組人血管內(nèi)皮抑制素(rh-Endostatin,Endostar,商品名:恩度)購自山東煙臺先聲麥得津公司,日本OlympusIMT-2倒置相差顯微鏡,日本OlympusCH-2光學普通顯微鏡,日本StatFax-2100酶標儀,日本佳能A640數(shù)碼相機;“電子尺”軟件V1.06為上海師范大學開發(fā)。1.2方法1.2.1MTT實驗取對數(shù)生長期的HNE-1細胞,按每孔4×103個接種于96孔板,每組設(shè)4個復孔,分別作用24、48、72h。實驗組每孔加含恩度終濃度分別為1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml和50μg/ml的15%新生牛血清DMEM,對照組加等體積的15%新生牛血清DMEM,并設(shè)空白對照。將培養(yǎng)板移入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,每隔24h取一塊96孔板,每孔加入20μlMTT,37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4h,小心吸除培養(yǎng)液,加入150μlDMSO,振蕩10min(1000r/min),在StatFax-2100酶標儀上測定492nm吸光值(OD)。實驗重復3次。1.2.2創(chuàng)傷修復實驗檢測細胞遷移取對數(shù)生長期的HNE-1細胞,制成單細胞懸液,以5×104/孔接種于96孔板中,細胞貼壁(約90%融合生長)后,以移液器槍頭在孔的底部劃“一”字形劃痕,以PBS沖洗,實驗組加含不同濃度恩度(10、20、40μg/ml)的無血清DMEM,對照組只加無血清DMEM,每組設(shè)4個復孔,即刻攝像記錄,于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后分別攝像記錄,用“電子尺”軟件分別測量每組0、24h劃痕兩側(cè)細胞間的距離,用0h劃痕邊緣的距離減去24h遷移邊緣的距離,取3次測量平均值表示遷移距離。遷移速度=遷移距離÷遷移時間,重復實驗3次。1.2.3體外管道形成實驗(1)取96孔培養(yǎng)板每孔加入40μlMatrigel(按1∶2與預冷無血清DMEM稀釋),置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30min使其凝固,在包被Matrigel的96孔板上分別接種HNE-1細胞和CRL-1730各6×103個/200μl(用無血清DMEM配制細胞懸液);(2)分別取對數(shù)生長期的HNE-1細胞和內(nèi)皮細胞CRL-1730制成單細胞懸液,按1∶1比例制成混合細胞懸液,以每孔混合細胞6×103個/200μl加入到已包被Matrigel的96孔板上,均每隔4h觀察,12h后終止培養(yǎng),95%乙醇固定2min,HE染色,攝像記錄,重復實驗3次。1.2.4體外管道形成抑制實驗在已包被Matrigel(方法同上)的96孔板中,每孔添加200μl含6×103個HNE-1細胞懸液(用無血清DMEM配制),實驗組及對照組處理同創(chuàng)傷修復試驗。37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng),每隔4h觀察不同處理組之間的HNE-1細胞管狀排列情況及完整程度,12h后終止培養(yǎng),顯微鏡下(×40)隨機取上、下、左、右、中心5個視野,計數(shù)管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量,取每個視野的平均值。1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行分析,實驗數(shù)據(jù)均用xˉ±sxˉ±s表示,多組均數(shù)比較用方差分析,相關(guān)性比較采用Pearson分析方法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1恩度對肺癌hne-1細胞增殖的抑制作用MTT檢測結(jié)果表明,實驗組的OD值與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),不同濃度的恩度組之間的生長抑制率無明顯的劑量依賴性(r=-0.005,P>0.05),提示恩度(1～50μg/ml)對鼻咽癌HNE-1細胞的增殖無明顯抑制作用。參見表1。2.2恩度對hne-1細胞體外遷移能力的影響創(chuàng)傷修復實驗顯示恩度(0、10、20、40μg/ml)作用24h,HNE-1細胞遷移的平均速度分別為1.53±0.038、1.03±0.063、0.71±0.058、0.46±0.028(μm/h),表明恩度能夠顯著降低HNE-1細胞的體外遷移能力(P<0.01),其濃度與遷移速度呈負相關(guān)(r=-0.983,P<0.01)。2.3血管網(wǎng)狀樣結(jié)構(gòu)的形成在Matrigel上,HNE-1細胞能模擬血管內(nèi)皮細胞樣的特性,出現(xiàn)長梭樣的細胞形態(tài),細胞之間互相連接,約12h后形成血管網(wǎng)狀樣結(jié)構(gòu)(圖1),形成過程與內(nèi)皮細胞相似(圖2),但其變形能力不及內(nèi)皮細胞;與內(nèi)皮細胞CRL-1730混合培養(yǎng),兩種能夠互相連接,共同構(gòu)成馬賽克血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3)。2.4各組每視野面臨的業(yè)對照組所形成的管道結(jié)構(gòu)排列整齊且較多而完整,呈單個環(huán)狀或多個環(huán)相連的網(wǎng)格狀;恩度組細胞可以形成管道狀結(jié)構(gòu),但數(shù)目少于對照組,環(huán)狀結(jié)構(gòu)斷裂。于顯微鏡下觀察,對照組平均每視野管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量為41.93±1.72,明顯高于恩度組(10、20、40μg/ml),平均每視野管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量分別為35.4±1.91、21.6±3.13及6.21±1.12(P<0.01),其管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量與恩度濃度呈負相關(guān)(r=-0.978,P<0.01)。見圖4、圖5。3恩度對hne-1細胞增殖及血管擬態(tài)的影響本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽低分化鱗癌HNE-1細胞在體外Matrigel上能夠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),HNE-1細胞的變形過程與內(nèi)皮細胞極其相似;HNE-1和內(nèi)皮細胞之間能互相連接共同構(gòu)成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),形成馬賽克血管,提示HNE-1腫瘤細胞具有血管擬態(tài)生成的能力,同時HNE-1能直接或間接刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖,并與內(nèi)皮細胞相互作用形成新生血管網(wǎng)。這與文獻報道的結(jié)果相符。說明腫瘤的血管生成也并非僅依賴于單一的內(nèi)皮細胞,在特定的條件下,腫瘤細胞自身可形成類似血管的通道,或與內(nèi)皮細胞共同形成起血管作用的通道。本研究均是在無血清條件下,體外模擬腫瘤缺乏營養(yǎng)的生長狀態(tài)下完成。腫瘤細胞之所以能夠模仿內(nèi)皮細胞形成血管擬態(tài)的機制仍未完全明確。研究認為與內(nèi)皮相關(guān)基因Tie-1、Tie-2以及VE-cadherin、EphA2、Laminin5-γ2、MMPs、VEGF-C、LYVE1、TF和NOTCH等蛋白的生物活性有關(guān)。最近的研究也表明腫瘤血管擬態(tài)與遷移誘導蛋白-7(migration-inducingprotein-7,Mig-7)的表達有密切的關(guān)系,Mig-7水平升高能夠促進腫瘤細胞的侵襲和血管擬態(tài)樣結(jié)構(gòu)的形成,促進其變形和模擬內(nèi)皮細胞生物學特性的能力。恩度是內(nèi)源性血管內(nèi)皮生長抑制劑的重組制劑,具有抗腫瘤血管生成且無明顯的毒副作用。本研究結(jié)果表明,恩度對鼻咽癌細胞無明顯的增殖抑制作用,但可以抑制HNE-1細胞的遷移及體外血管擬態(tài)形成,且抑制作用與濃度相關(guān),提示恩度既能夠抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管腔的形成,也可能具有抑制腫瘤細胞的血管