分子生物學(xué)課件 第六章 轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄

第六章轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄重難點(diǎn)轉(zhuǎn)錄后加工、真原核轉(zhuǎn)錄過程、增強(qiáng)子、終止與抗終止、RNA聚合酶〔真原核〕、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物㈠轉(zhuǎn)錄一轉(zhuǎn)錄的定義與特點(diǎn)1.轉(zhuǎn)錄的定義：以DNA為模板，在依賴DNA的RNA聚合酶的催化下，以4種NTP〔ATP、CTP、GTP和UTP〕為原料，合成RNA的過程。2.轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性：在RNA的合成中，DNA的兩條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板。且多基因DNA中正負(fù)鏈可相間排列轉(zhuǎn)錄單向性：RNA5’→3’合成轉(zhuǎn)錄連續(xù)性：共線性，RNA與DNA序列一一對(duì)應(yīng),RNA鏈連續(xù)合成有特定起始、終止位點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)子、終止子雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄能力大于單鏈：RNA聚合酶與雙鏈結(jié)合后活性高于單鏈不需完全開鏈：只需局部解鏈，最后DNA還是雙鏈※幾個(gè)概念1.正鏈：與mRNA序列相同〔T→U〕的那條DNA鏈,編碼鏈〔有義鏈〕負(fù)鏈：根據(jù)堿基互補(bǔ)原那么指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈,模板鏈〔反義鏈〕2.轉(zhuǎn)錄單元：一段從啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的DNA序列，轉(zhuǎn)錄的功能單元3.啟動(dòng)子：一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，特異識(shí)別模板4.終止子：二轉(zhuǎn)錄的過程概述1.模板識(shí)別：原核細(xì)胞中：模板識(shí)別階段主要指RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。真核細(xì)胞中：需要一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子〔輔助蛋白〕，RNA聚合酶才能識(shí)別啟動(dòng)子并形成轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物〔PIC〕。※拼板理論：真核RNA聚合酶、反式元件、順式元件相互作用使轉(zhuǎn)錄起始3.轉(zhuǎn)錄延伸：RNA聚合酶釋放σ因子，核心酶沿著模板DNA移動(dòng)并使新生RNA鏈不斷伸長(zhǎng)的過程。4.轉(zhuǎn)錄終止：當(dāng)RNA鏈延伸到終止位點(diǎn)時(shí)，RNA停止合成，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA鏈復(fù)原，新生RNA鏈和RNA聚合酶將被釋放下來?！D(zhuǎn)錄所需的酶與復(fù)合物RNA聚合酶：是轉(zhuǎn)錄過程中最關(guān)鍵的酶，主要以雙鏈DNA為模板，以4種核苷三磷酸作為活性前體，并以Mg2+/Mn2+為輔助因子，催化RNA鏈的起始、延伸和終止，它不需要任何引物，催化生成的產(chǎn)物是與DNA模板鏈互補(bǔ)的RNA?！松镏灰环NRNA聚合酶，真核生物有三種※真原核RNA聚合酶總結(jié)真核RNA聚合酶：RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ，對(duì)應(yīng)三種內(nèi)含子RNA聚合酶Ⅱ?yàn)殛P(guān)鍵酶〔對(duì)應(yīng)hnRNA→mRNA〕，需反式因子作用下起作用n型內(nèi)含子：RNA聚合酶n對(duì)應(yīng)的內(nèi)含子RNA聚合酶Ⅰ--rRNA,對(duì)α-鵝膏蕈堿不敏感RNA聚合酶Ⅱ--hnRNA→mRNA,對(duì)α-鵝膏蕈堿敏感RNA聚合酶Ⅲ--tRNA,對(duì)α-鵝膏蕈堿有種屬特異性原核RNA聚合酶：全酶-〔α2ββ’〕σ核心酶-α2ββ’活性中心-ββ’★σ因子結(jié)構(gòu)：六聚體蛋白、具有NTP酶和解螺旋酶活性，促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。σ因子作用：與啟動(dòng)子-35區(qū)識(shí)別作用機(jī)理：※RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別：RNA聚合酶DNA聚合酶大小大，4.8×105da小，1.09×105da引物不需要需要產(chǎn)物較短，游離較長(zhǎng)，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時(shí)進(jìn)行外切酶活性無5’3’，3’5’校對(duì)合成能力無有修復(fù)能力無有轉(zhuǎn)錄復(fù)合物〔反式因子〕：三啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始⑴啟動(dòng)子定義：能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段起始位點(diǎn)上游的DNA序列?！陆低蛔儯?jiǎn)?dòng)子突變后，啟動(dòng)子活性下降上升突變：?jiǎn)?dòng)子突變后，啟動(dòng)子活性上

升⑵轉(zhuǎn)錄單元：起始位點(diǎn)：

※上游序列：-n表示

下游序列：+n表示

-n…-3-2-1起始位點(diǎn)+1+2+3…+n※啟動(dòng)子中幾個(gè)重要的序列：原核生物：-10區(qū)：TATAAT，位于上游10bp處，RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)〔富含AT堿基，利于雙鏈翻開〕-35區(qū)：TTGACA，位于上游35bp處，RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)，決定轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的強(qiáng)弱△-10區(qū)與-35區(qū)之間的距離：16～19bp，小于15bp或大于20bp都會(huì)降低啟動(dòng)子的活性。適宜的距離可以為RNA聚合酶提供適宜的空間結(jié)構(gòu)，便于轉(zhuǎn)錄的起始。真核生物：TATA區(qū)：TATAAA，位于-25～-35，核心啟動(dòng)元件，使轉(zhuǎn)錄精確地起始，T85A97T93A85A63A83CAAT區(qū)：CCAAT，位于-70～-80，上游啟動(dòng)子元件，控制轉(zhuǎn)錄起始頻率GC區(qū)：GGGCGG,位于-80～-110，上游啟動(dòng)子元件，

控制轉(zhuǎn)錄起始頻率⑶啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別原核生物：RNA聚合酶與-35區(qū)識(shí)別〔σ因子作用下〕真核生物：RNA聚合酶與CG區(qū)、CAAT區(qū)識(shí)別⑷RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合原核生物：RNA聚合酶ββ’與-10區(qū)結(jié)合〔σ因子作用下〕真核生物：RNA聚合酶與TATA區(qū)結(jié)合〔反式因子作用下〕※增強(qiáng)子定義、結(jié)構(gòu)：作用機(jī)制：特點(diǎn)：代表：β-珠蛋白基因四終止子與抗終止不依賴ρ因子的終止子：RNA3’成莖環(huán)，又稱內(nèi)在終止子、強(qiáng)終止子內(nèi)在終止子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：終止位點(diǎn)上游存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA容易互補(bǔ)形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。終止位點(diǎn)前面有一段4～8個(gè)A組成的序列，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA的3′末端中相應(yīng)的有一連串U序列。新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致RNA聚合酶暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5’端正常結(jié)構(gòu)，寡聚U使雜合鏈3’端局部出現(xiàn)不穩(wěn)定rU·dA區(qū)域。兩者共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來。終止效率與二重對(duì)稱序列和寡聚U的長(zhǎng)短有關(guān)。長(zhǎng)度，效率。依賴于ρ因子的終止：ρ結(jié)合RNA富C區(qū)，發(fā)揮ATP酶、解旋酶活性，又稱弱啟動(dòng)子※真核的轉(zhuǎn)錄終止：終止修飾點(diǎn)處切離加尾有些終止點(diǎn)的DNA序列缺乏共性，不能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的自發(fā)終止，需要ρ因子的參與。大腸桿菌ρ-依賴型終止子占所有終止子的一半左右?！F追模型抗終止：定義：由于不同生理要求，轉(zhuǎn)錄過程中有時(shí)即使遇到終止信號(hào)，仍需要繼續(xù)轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象兩種類型：破壞終止位點(diǎn)RNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)：當(dāng)介質(zhì)中某一氨基酸的濃度較低時(shí)，缺乏相應(yīng)氨酰-tRNA，將致使核糖體滯留在串聯(lián)密碼子上，mRNA不能形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞，因此轉(zhuǎn)錄仍將繼續(xù)進(jìn)行，出現(xiàn)抗終止現(xiàn)象。依賴于蛋白質(zhì)因子的轉(zhuǎn)錄抗終止：蛋白復(fù)合物形成后，將會(huì)改變聚合酶的構(gòu)象，使之對(duì)終止信號(hào)不敏感，從而抗終止。五轉(zhuǎn)錄調(diào)控真核生物啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄影響原核生物啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄影響轉(zhuǎn)錄的抑制利福霉素〔利福平〕：專一結(jié)合原核生物RNA聚合酶β亞基嘌呤、嘧啶類似物：與DNA模板結(jié)合改變模板功能：烷化劑、放線菌素、嵌入染料與RNA聚合酶結(jié)合影響活性：利福霉素、利鏈菌素、α-鵝膏蕈堿※α-鵝膏蕈堿：真核RNA聚合酶Ⅱ抑制劑六內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄后加工真核RNA內(nèi)含子總述：真核的斷裂基因：外顯子與內(nèi)含子相間真核內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)：GT-AG※原核：tRNA、rRNA需加工，mRNA不加工真核：三種RNA都需加工hnRNA是mRNA的前體：RNA聚合酶Ⅱ催化下，生成hnRNA，經(jīng)5’加帽，3’加尾，連接外顯子入質(zhì)，成mRNAhnRNA內(nèi)含子的剪接〔hnRNA→mRNA〕hnRNA的內(nèi)含子上幾個(gè)剪切位點(diǎn)〔剪接因子結(jié)合位點(diǎn)〕：GU-AG：所有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)都是5’GU…AG3’3’AG的剪接效率：CAG=UAG>AAG>GAG3’AG附近嘧啶區(qū)：10-20個(gè)嘧啶核苷酸5’保守序列：GUPuAGU分叉剪接內(nèi)含子3’上游18-50處：Py80NPy87Pu75APy95保守區(qū)，A有2’-OHhnRNA內(nèi)含子GU-AG的剪接機(jī)理※真核生物內(nèi)含子變位剪接內(nèi)含子從mRNA前體〔hnRNA〕中被剪接，越過外顯子或某個(gè)剪接位點(diǎn)，產(chǎn)生組織、發(fā)育階段特異性mRNA三類rRNA內(nèi)含子的剪接Ⅰ類內(nèi)含子的剪接〔真核rRNA〕第一次轉(zhuǎn)酯：第二次轉(zhuǎn)酯：外顯子的連接：Ⅱ類內(nèi)含子的剪接〔線粒體、葉綠體rRNA〕第一次轉(zhuǎn)酯：第二次轉(zhuǎn)酯：外顯子的連接：RNA的編輯定義：某些RNA〔尤其是mRNA〕前體加工方式，包括：插入、刪除、取代核苷酸殘基，使DNA遺傳信息改變兩機(jī)制：位點(diǎn)特異性脫氨基作用：C→U，A→G，增遺傳容量引導(dǎo)U插入、刪除：意義：校正：恢復(fù)喪失的遺傳信息調(diào)控翻譯：構(gòu)建、去除起始、終止密碼子，以調(diào)控翻譯擴(kuò)充遺傳信息：使基因產(chǎn)物〔mRNA、Pro等〕獲得新功能※哺乳動(dòng)物載脂蛋白mRNA編輯脫氨：C→U※谷氨酸受體蛋白mRNA脫氨：A→IRNA的再編碼定義：RNA編碼、讀碼方式改變，以不同方式翻譯方式+1/-1移碼：核糖體跳躍：核糖體跳過翻譯中mRNA50個(gè)核苷酸終止子通讀：第21、22種氨基酸形成方式RNA的化學(xué)修飾最常見的六