激光熒光光譜診斷腫瘤的研究進(jìn)展

激光熒光光譜診斷腫瘤的研究進(jìn)展

激光是本世紀(jì)60年代最重要的科學(xué)技術(shù)成就之一。其特點(diǎn)是高亮度、方位、高單色性等特點(diǎn)。廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、通信、醫(yī)療、軍事等領(lǐng)域，以及許多重要的科學(xué)領(lǐng)域，導(dǎo)致了革命性的變化。激光熒光光譜技術(shù)用于診斷疾病具有靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn),患者易于接受。所以近年來國內(nèi)外應(yīng)用熒光光譜診斷腫瘤的研究相當(dāng)活躍,特別是早期診斷腫瘤方面已獲得了一定進(jìn)展,成為醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的一個重要方面。熒光分為原子熒光、分子熒光、自發(fā)熒光、外源性熒光。1激光光源在診斷中的應(yīng)用1.1激光熒光譜1.2hpd的應(yīng)用用激光熒光譜技術(shù)診斷腫瘤的方法早在70年代初期就引起了人們的關(guān)注。近年來獲得新發(fā)展,腫瘤熒光輻射有兩種類型:一是由腫瘤組織本身經(jīng)紫外光激發(fā)的,稱自體熒光;另一種是聚集在腫瘤組織上熒光物質(zhì)作光敏劑經(jīng)激發(fā)后發(fā)出,然后根據(jù)熒光光譜對腫瘤進(jìn)行鑒別診斷。使用熒光藥物診斷腫瘤為其中的一種,在生物醫(yī)學(xué)研究中常用的熒光物質(zhì)主要有熒光素鈉鹽,血卟啉衍生物,即HPD(HematoporphyrinDirivative)。熒光素鈉鹽是在醫(yī)學(xué)臨床診斷中很早就被采用的一種生物染料,屬三苯甲烷的衍生物,為水溶性。其水溶液經(jīng)紫外光激發(fā),能產(chǎn)生黃綠色熒光,峰值約在522nm。熒光素鈉鹽,對惡性腫瘤有親和性,在氦鎘激光照射下會發(fā)出肉眼可見的黃綠色熒光,這就是癌腫鑒別的依據(jù)。上海、西安等地用氦鎘激光照射口服或灌腸,靜注熒光素鈉鹽的腫瘤患者,對胃癌,子宮頸癌,鼻咽癌進(jìn)行了早期診斷,其臨床診斷的準(zhǔn)確率達(dá)到85%以上。西安醫(yī)學(xué)院附屬一院給患者用3g熒光素鈉,加入150ml生理鹽水中保留灌腸1～3h,然后把輸出功率為20mV的氦鈉激光經(jīng)光導(dǎo)纖維導(dǎo)入胃內(nèi)進(jìn)行胃鏡檢查,若為黃綠色熒光就為癌腫組織,癌的檢出率為94%。南通醫(yī)學(xué)院使患者口服1g熒光素鈉1～2h后,再用氦鎘激光照射患者病變部位,癌腫處黃綠色或紫綠色熒光。100例激光熒光法檢查患者與病理檢查一致有84例,占84%。熒光素鈉鹽對腫瘤的親和力和滯留時間均不如HPD,自70年代激光和光導(dǎo)纖維技術(shù)的發(fā)展為HPD診斷及治療惡性腫瘤帶來了新的飛躍。HPD是卟啉類化合物的一種,其分子式為C34H38O6N4。它的Pπ共軛體系的化學(xué)結(jié)構(gòu)式使其很容易接受光能而產(chǎn)生電子躍遷而發(fā)射熒光。其吸收光譜是320～500nm,峰值波段在390～410nm,而它的熒光發(fā)射光譜是600～700nm,峰值波在620～640nm,HPD在人血清中的熒光激發(fā)光譜的峰值波長為405nm,熒光發(fā)射光譜的峰值波長是630nm和690nm,不同波長的光激發(fā)熒光的效率有明顯的差別。因此,一般盡可能選擇HPD熒光激發(fā)光譜中的峰值波長作為激發(fā)光的波長。HPD在惡性腫瘤上的積累和滯留時間比周圍組織和良性腫瘤上要大的多,經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)用HPD注射在移植有惡性腫瘤的小鼠上,注射量為10mg/kg,經(jīng)24～48h后,發(fā)現(xiàn)腫瘤上含量比皮膚大兩倍,比肌肉大10～15倍,而HPD從腫瘤組織排出體外比正常組織晚72h。利用HPD診斷腫瘤的基本方法有:給患者靜脈注射一定量的HPD,注射2d后用紫外激光照射病變部位,凡能發(fā)出紅色熒光者,就被診斷是惡性腫瘤為陽性。早在1935年,RassmussenTaxdal用500～1000mg大劑量血卟啉給11例癌腫患者靜脈注射,其中8例用光照射,出現(xiàn)紅色熒光。血卟啉衍生物制成后,注射劑量減為2～5mg/kg,而在腫瘤中的熒光效應(yīng)進(jìn)一步提高。1966年,Lipson對121例癌腫可疑患者進(jìn)行檢驗(yàn),高度評價了HPD熒光檢查術(shù)對惡性腫瘤的診斷價值。特別是對其中14例患者活檢為陰性,而HPD熒光檢查為陽性,然后在熒光顯示處取活檢,證實(shí)有惡性變化。對13例活檢診斷為良性宮頸病變患者,但在顯示紅色熒光處取活檢,其中10例有異常增生,1例慢性炎癥,說明對癌腫前期診斷有價值。1968年,Greorie等人報道了對226例腫瘤患者的診斷結(jié)果,其中173例患者有惡性腫瘤,所檢查癌腫有乳腺癌,宮頸癌,喉癌,肺癌,基底細(xì)胞癌,皮膚鱗癌,食道癌,黑色素癌,視網(wǎng)膜細(xì)胞癌等。熒光診斷為陽性的有132例,占76.4%,而18例假陽性已證明是由于技術(shù)原因造成。其他53例患有良性腫瘤中有12例可以看到弱熒光為假陽性。1979年Doiron報道了用熒光內(nèi)窺鏡和影像增強(qiáng)系統(tǒng)診斷出僅有100nm厚的癌腫。北醫(yī)大用輸出功率為25mW的氦鎘激光或30～50mW的氬離子激光照射有HPD的145只金地黃地鼠模型的111塊鱗狀上皮癌標(biāo)本和113塊重度上皮異常增生標(biāo)本,實(shí)驗(yàn)結(jié)果鱗狀上皮癌和重度上皮異常增生全部顯示出紅色熒光,輕度上皮增生熒光顯示率也達(dá)到98.44%,他們同時用HPD對353例癌腫患者診斷,其準(zhǔn)確率達(dá)到88%,說明激光HPD熒光法對癌腫和癌前病變均有一定的診斷意義和價值。以上用HPD熒光目測法觀察熒光色澤和強(qiáng)度,優(yōu)點(diǎn)是簡單直觀,缺點(diǎn)是靈敏度較低,沒有客觀的科學(xué)指標(biāo)可記錄和對比,容易產(chǎn)生主觀誤差。另外有些正常組織在紫外光照射下也會發(fā)出固有熒光,如正常氣管粘膜有580nm左右較強(qiáng)的固有熒光,炎性壞死組織及良性腫瘤組織也會發(fā)出紅色熒光。因此,正確有效的方法是對激光HPD診斷惡性腫瘤時做光譜分析,如對注射有HPD的胃癌患者,48h后經(jīng)激光內(nèi)窺鏡檢測胃癌病灶。胃癌糜爛區(qū)及周圍正常細(xì)胞3個區(qū)域靜態(tài)熒光,再與動態(tài)熒光光譜比較,發(fā)現(xiàn)隨著注射HPD后時間的延長,胃癌病灶區(qū)出現(xiàn)了新發(fā)射帶,而其他兩區(qū)域均無此發(fā)射帶。隨著激光,光導(dǎo)纖維等新技術(shù)的發(fā)展,激光HPD熒光診斷腫瘤的范圍已在不斷的擴(kuò)展。對原位癌,間變癌灶的診斷日益顯示其獨(dú)特優(yōu)點(diǎn),當(dāng)正常組織發(fā)生惡變的早期出現(xiàn)不典型增生時,HPD就有滯留,因此可用HPD指示正確的活檢部位,提高活檢的陽性檢出率,從而達(dá)到早期診斷。它還能確定癌腫表面的邊界,有助于指示手術(shù)或光學(xué)治療的范圍。因此近年來激光HPD熒光診斷腫瘤方法日益受到重視。但對惡性腫瘤組織能選擇吸收HPD機(jī)制目前尚不完全清楚,熒光光譜儀器設(shè)備和技術(shù)上還存在不少問題,有待進(jìn)一步研究解決,由于炎癥,創(chuàng)傷,出血,舌根部淋巴組織吸收HPD較多等原因,均可對診斷造成假陽性。故目前激光HPD熒光法主要用于惡性腫瘤定位,最后還需依靠活組織的病理檢查。HPD雖已是目前最優(yōu)的光敏劑,但仍不理想,如在體內(nèi)滯留時間較長,易引起皮膚的光敏反應(yīng),用藥期間患者需避光等,從而減低了患者的依從性,目前國內(nèi)外均在尋找新的光敏劑如國外的碳化鋅酞菁,這種藥物在體內(nèi)停留的時間更短,而在腫瘤組織內(nèi)能潴留的濃度更高,因內(nèi)則還在研究葉綠素衍生物(CPD)、竹紅菌素以及蠶砂卟啉等光敏物質(zhì)的應(yīng)用價值。1.3自體熒光與正常結(jié)腸的比較上述的研究觀察主要是主峰位置的變化,而強(qiáng)度等方面的差異不明顯。1989年,Yakshe等對正常結(jié)腸和結(jié)腸癌標(biāo)本的光譜分析,發(fā)現(xiàn)正常結(jié)腸的熒光強(qiáng)度較強(qiáng),而癌組織的較弱。正常結(jié)腸在400nm和450nm處有兩個譜峰,癌組織也有上面的兩個譜峰,但在453nm處有較低的峰值,他們沒有發(fā)現(xiàn)紅光側(cè)的特征峰。他們將所測的結(jié)果與病理結(jié)果作比較,符合率100%,認(rèn)為可以作為臨床區(qū)分結(jié)腸癌的手段之一。自體熒光在檢查癌前病變及指示活檢方面也顯示出其優(yōu)點(diǎn),如對患有口腔鱗狀上皮細(xì)胞非典型增生的患者作自體熒光光譜檢測,發(fā)現(xiàn)輕度非典型增生的光譜表現(xiàn)為陰性,而高度非典型增生的光譜呈陽性,與活檢結(jié)果完全相符。熒光光譜技術(shù)有可能在形態(tài)學(xué)上還沒有明顯的特征之前提示病變信息,故可與形態(tài)學(xué)診斷相配合。1.4正常結(jié)腸和癌組織的熒光強(qiáng)度差異1986年,上海蕭樹東等將光纖從內(nèi)鏡活檢鉗通道導(dǎo)入胃腔,照射胃癌組織和胃的其他病變組織,然后對產(chǎn)生的自體熒光快速記錄,光譜分析顯示結(jié)果,發(fā)現(xiàn)胃癌和部分慢性萎縮性胃炎患者的自體熒光光譜在630nm和690nm處有特征峰出現(xiàn),胃癌的特征峰檢出和病理診斷符合率達(dá)89.5%而正常胃粘膜和淺表性胃炎者無此特征峰出現(xiàn)。國外內(nèi)鏡下激光光譜研究主要見于結(jié)腸鏡下,Cothren等通過結(jié)腸鏡的研究發(fā)現(xiàn)正常組織在460nm處的熒光譜強(qiáng)度明顯高于癌組織,約為4倍,但在650nm處,癌組織的光譜強(qiáng)度略高于正常組織,用這些特征值區(qū)別正常結(jié)腸和異常癌組織,與病理結(jié)果作對照,敏感性、特異性、陽性預(yù)測值分別是100%、97%、94%,而Crus,Kapadia等卻發(fā)現(xiàn)正常結(jié)腸在390nm處有一主峰,在460nm處有一次峰,而癌組織只有一個在470nm處的主峰,正常與異常組織間在強(qiáng)度上沒有明顯差別。Marchesini等的結(jié)果又有所不同,他們發(fā)現(xiàn)癌組織的光譜在500nm處峰值最高,在630nm和670nm處還有兩個次峰出現(xiàn),正常組織的熒光強(qiáng)度要大于癌組織。Gottirdi等的研究結(jié)果也基本類似。Jaclynhnng的研究也認(rèn)為強(qiáng)度閾值可以作為區(qū)分結(jié)腸癌的主要參數(shù),他們發(fā)現(xiàn),正常結(jié)腸的激光熒光光譜強(qiáng)度明顯高于癌組織,大約為5～6倍,正常結(jié)腸和癌組織的激光熒光光譜有兩個峰,主峰在510nm,次峰在620nm,其差別主要表現(xiàn)在強(qiáng)度上,Essier等也從激光熒光光譜強(qiáng)度值與主峰位置上報道了正常結(jié)腸與異常結(jié)腸間的差異。自1993年起,我們首先在國內(nèi)開始研究結(jié)腸癌的激光熒光光譜。我們所采用的是脈沖式氮分子激發(fā)器,激光波長為337nm,脈沖寬度為6ns,單脈沖輸出能量為6mj,重復(fù)頻率10Hz,完全符合誘發(fā)熒光的設(shè)備要求。頭一階段先對50例離體結(jié)腸癌的標(biāo)本進(jìn)行研究。通過近千條光譜曲線的分析,我們發(fā)現(xiàn)正常結(jié)腸在460nm處有一主峰,在400nm處有一次峰。主峰相對強(qiáng)度較結(jié)腸癌強(qiáng),主峰近紅光側(cè)下降較快,我們還選擇了一個比值F1,它為光譜曲線400nm處的強(qiáng)度與530nm處的強(qiáng)度比,正常組織F1為1.29,主峰相對強(qiáng)度為12028,主峰位于460nm,結(jié)腸癌組織主峰在470nm,次峰在390nm,主峰相對強(qiáng)度較正常結(jié)腸弱,主峰近紅光側(cè)下降緩慢,主峰強(qiáng)度為正常結(jié)腸強(qiáng)度的1/3～1/5,結(jié)腸癌組織F1為0.43,主峰相對強(qiáng)度為3970,主峰值于470nm,第二階段我們通過結(jié)腸鏡活檢鉗孔道導(dǎo)入光纖,給患者進(jìn)行激光熒光光譜檢測,同時與病理結(jié)果對比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不但診斷符合率很高,而且可指示活檢部位,提高了結(jié)腸腫瘤的檢出率,我們的初步研究證實(shí)激光熒光光譜技術(shù)可以作為區(qū)別結(jié)腸惡性腫瘤的方法之一。2內(nèi)源性芐啉和蛋白的熒光目前對于癌組織自發(fā)熒光物質(zhì)的來源存在許多不同的說法,Kevin等認(rèn)為正常結(jié)腸光譜在390nm和460nm處有高峰出現(xiàn),與相應(yīng)的物質(zhì)作對比后確信這兩個峰來自腸壁內(nèi)的膠原蛋白和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。在正常腸壁這兩種物質(zhì)含量較多,因而熒光強(qiáng)度較高,而在癌組織,由于癌細(xì)胞的破壞作用,正常的腸粘膜被癌組織所取代,癌組織的熒光較弱,因而癌組織的熒光強(qiáng)度較低,而在425nm處有一低峰,是由于血紅蛋白吸收所致熒光強(qiáng)度的下降。Romer等人認(rèn)為正常結(jié)腸的熒光主峰來自腸壁內(nèi)的膠原蛋白等,其熒光強(qiáng)度高,主峰偏紫光側(cè)癌組織的熒光主要來自癌組織內(nèi)的卟啉類物質(zhì),主峰偏紅光側(cè)。國內(nèi)楊遠(yuǎn)龍等認(rèn)為由于癌組織的特征熒光光譜峰在630nm及690nm附近,與卟啉的特征熒光峰相合,所以認(rèn)為癌組織的特征熒光峰是由卟啉產(chǎn)生的,但這卟啉不是體外注入的,而是來自生物體內(nèi)的內(nèi)源性卟啉。但通過比較研究活體癌組織的熒光光譜與純卟啉的熒光光譜,兩者有明顯的區(qū)別,這說明癌組織中的發(fā)光物質(zhì)并不是純的卟啉,而是卟啉和癌組織相結(jié)合產(chǎn)生的某種化合物。人體內(nèi)的卟啉化合物主要來源于血紅蛋白的分解,但含鐵的卟啉環(huán)(血紅素)沒有熒光,只有當(dāng)血紅素失鐵后才成為有熒光的卟啉,稱之為內(nèi)源性卟啉,1975年,Daviol等對生物組織的元素分析發(fā)現(xiàn),許多癌腫樣品的含鐵量比正常組織低,這與不含鐵的產(chǎn)生熒光的卟啉在癌組織中積聚這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象是一致的。癌組織中內(nèi)源性卟啉含量的增多與癌組織周圍毛細(xì)管的增殖有關(guān),當(dāng)癌細(xì)胞發(fā)展成細(xì)胞團(tuán)時,為了攝取足夠的氧和營養(yǎng),釋放出一種血瘤自管生成因子它刺激鄰近的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,長出新的毛細(xì)血管,伸向腫瘤。因此癌組織內(nèi)部的血流量比正常組織豐富的多。這可能導(dǎo)致血紅蛋白分解產(chǎn)物—卟啉在癌組織中積聚,表現(xiàn)出激光激發(fā)下的特征熒光。但許多學(xué)者報道癌組織未見到所說的特征熒光,故上述看法也有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。李連等認(rèn)為癌組織的熒光是卟啉與蛋白的復(fù)合物的熒光。其中蛋白必含有芳香氨基酸。在光的作用下,卟啉和蛋白的復(fù)合物產(chǎn)生有效能量轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出敏化熒光峰,這些敏化熒光在不同的介質(zhì)條件下,其強(qiáng)度和峰位可能有所不同。與此有關(guān)的問題還有待深入研究。綜上所述,正常組織與腫瘤組織間激光熒光光譜有顯著差異。不論是主峰位置,還是在強(qiáng)度上都有不同。盡管其間的規(guī)律還須深入研究探索,但激光熒光光譜區(qū)分正常組織與癌組織是可行的。激光熒光光譜技術(shù)是一個很有發(fā)展前途的新技術(shù)。隨著激光技術(shù)的發(fā)展,氙離子激光、氮分子激光、氪離子激光、可調(diào)染料激光等均作為激勵光源,可觀察并記錄腫瘤組織的特征熒光,激光熒光光譜儀由激勵光源、傳輸光纖及熒光檢測記錄系統(tǒng)三部分組成。生物分子本身存在于生物組織中的光敏物質(zhì),在不用外加血卟啉光敏物質(zhì)的條件下,生物組織受激光激發(fā)而產(chǎn)生的熒光稱為自體熒光,它是生物組織更為本質(zhì)的反映,且利用自體熒光,避免了使用光敏劑所帶來的副作用,患者易于接受。生物組織中的膽紅素,核黃素,卟啉,VB6等為內(nèi)源性的熒光物質(zhì),早在1924年,Policard首先在實(shí)驗(yàn)中觀察到腫瘤組織自體熒光,日本的熊谷博彰等從1979年對胃癌粘膜的