殼聚糖百里香酚復(fù)合物抑菌活性研究

殼聚糖百里香酚復(fù)合物抑菌活性研究

0殼聚糖和百里香酚的抑菌活性地殼聚糖（cs）是甲殼素-（1,4）-2-羥色胺-2-脫氧葡萄糖。通過(guò)脫歐基反應(yīng)獲得的高純度天然藥物。地殼中的糖形成c-2位高氧化鉀，并在ph-6的介質(zhì)中形成離子。因此，它比甲殼素具有更好的解釋性和抗菌性。作為一種天然的抗菌劑和食品洗滌劑，具有良好的應(yīng)用前景。最近幾十年來(lái),隨著對(duì)百里香屬植物成分研究的深入,百里香的應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣,百里香揮發(fā)油中所含的主要成分為百里香酚(thymol),它具有殺菌、祛痰、殺螨、祛蛔的作用.各種抗菌劑都有一定的抗菌譜.在實(shí)際應(yīng)用中,常常使用各種防腐劑的混合物.目前關(guān)于殼聚糖、百里香酚的抑菌活性都有報(bào)道,但有關(guān)殼聚糖與其他抗菌物質(zhì)復(fù)合后的抑菌活性未見(jiàn)報(bào)道,為了確定殼聚糖與百里香酚復(fù)合后抑菌活性是否增強(qiáng),本文研究了殼聚糖、百里香酚及其復(fù)合物的抑菌活性以及配比濃度、pH值、乳化劑對(duì)復(fù)合物抑菌活性的影響.為它們?cè)谑称贰⑨t(yī)藥、日用品等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù).1材料和方法1.1細(xì)菌和真菌的制備殼聚糖由北京遠(yuǎn)東公司提供,分子量約40×104,脫乙酰度為83%.百里香酚,AR,中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購(gòu)供應(yīng)站.殼聚糖液、百里香酚液及其復(fù)合物的制備:將殼聚糖溶于1%醋酸溶液得1%殼聚糖液,用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為5.4;百里香酚用吐溫-80作乳化劑得1%百里香酚液,同樣調(diào)節(jié)pH為5.4;兩種溶液按1∶1(V/V)混合,充分混勻,放置兩天,能形成穩(wěn)定溶液(不發(fā)生相分離現(xiàn)象,也不發(fā)生沉淀和絮凝現(xiàn)象),即得殼聚糖-百里香酚復(fù)合物溶液.細(xì)菌包括革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcuaaureus)、表皮葡萄球菌(StaphylococcuaEpidermis)、棒狀桿菌(CorynebactXerosics)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)、綠膿桿菌(Bacteriumaeruginosa),真菌有白色念珠菌(Candidaalbicans),由湖北省人民醫(yī)院提供.采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(牛肉膏2.0g,蛋白胨10.0g,NaCl5.0g,瓊脂20.0g,水1000mL,自然pH).菌懸液的制備:將菌種活化后,接種到肉湯蛋白胨平板上,置恒溫培養(yǎng)箱中,細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h,真菌在28℃下培養(yǎng)38h,培養(yǎng)至菌種生長(zhǎng)良好.用無(wú)菌棉簽蘸取少量菌落于生理鹽水中,搖勻,稀釋成一定濃度的菌懸液,約107～108CFU/mL.1.2無(wú)菌試驗(yàn)方法1.2.1最低抑菌濃度mic測(cè)定聚合物的抑菌效果用無(wú)菌水將1%殼聚糖和百里香酚液進(jìn)行對(duì)倍稀釋,溶液pH值都是5.4,用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制成含不同質(zhì)量濃度藥物的雙蝶平板,使殼聚糖和百里香酚最終濃度為0.1%(1g/L),0.05%(0.5g/L),0.025%(0.25g/L),0.0125%(0.125g/L),0.0063%(0.063g/L),0.0031%(0.031g/L).然后劃線法接種,平板置于37℃(細(xì)菌24h)或28℃(真菌38h)恒溫箱中培養(yǎng),觀察菌的生長(zhǎng)情況,每一質(zhì)量濃度作3組平行試驗(yàn),以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低濃度為最低抑菌濃度(MIC).同理測(cè)定復(fù)合物的最低抑菌濃度.以不含藥物的瓊脂平板作為菌生長(zhǎng)對(duì)照,并作醋酸(pH5.4)或吐溫-80的瓊脂平板對(duì)照.1.2.2抑菌活性測(cè)定制取含一定量藥品的平板,接種菌,分別在19,38,62,86,110,134h觀察菌生長(zhǎng)情況,從是否抑菌和觀察到長(zhǎng)出菌之前的抑菌時(shí)間上判斷抑菌活性的強(qiáng)弱.1.2.3殼聚糖混合物的抑菌活性測(cè)定分別測(cè)定最終濃度為0.25,0.125,0.063,0.031,0.015g/L百里香酚和0.5g/L殼聚糖的復(fù)合物以及0.125g/L百里香酚和0.5,0.25,0.125,0.063,0.031g/L殼聚糖的復(fù)合物的抑菌活性,說(shuō)明不同配比濃度對(duì)殼聚糖復(fù)合物抑菌活性的影響.1.2.4ph對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的影響用1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基和最終濃度為0.5g/L殼聚糖-0.125g/L百里香酚復(fù)合物pH為4.6,5.0,5.4,5.8,6.2,6.6,比較不同pH條件下,對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的影響.1.2.5百里香酚乳液的制備分別用1.0%～2.0%吐溫-80和司班-20作乳化劑使一定量百里香酚在水中形成均勻乳液,并將兩種乳液分別和殼聚糖液復(fù)合,說(shuō)明兩種乳化劑對(duì)百里香酚液及復(fù)合物抑菌活性的影響,并做兩種乳化劑的瓊脂平板的對(duì)照.2結(jié)果與討論2.1殼聚糖的抗菌機(jī)理由表1可以看出,低濃度殼聚糖除對(duì)白色念珠菌的抑制作用較差以外,對(duì)其它5種細(xì)菌抑制作用較強(qiáng),雖然0.1%醋酸溶液對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌有抑制作用,但0.05%醋酸溶液對(duì)6種菌均無(wú)抑制作用,而殼聚糖對(duì)5種細(xì)菌的最低抑菌濃度都不大于0.05%,說(shuō)明這種抑菌作用與殼聚糖本身有關(guān),目前有關(guān)殼聚糖抑菌活性的研究都表明殼聚糖具有抗菌作用,但到目前為止,殼聚糖的抑菌機(jī)理尚無(wú)定論.人們提出了多種抗菌機(jī)理,第一種機(jī)理認(rèn)為,殼聚糖的聚陽(yáng)離子與微生物帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜作用,使細(xì)胞發(fā)生凹陷、變形和泄漏;第二種機(jī)理認(rèn)為,殼聚糖能夠結(jié)合一些有機(jī)體正常生長(zhǎng)所必需的金屬元素、微量元素或必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從而抑制微生物生長(zhǎng);第三種機(jī)理認(rèn)為,殼聚糖能活化宿主組織的防御過(guò)程,結(jié)合水分和抑制酶的活動(dòng).第四種機(jī)理認(rèn)為,殼聚糖透過(guò)微生物的細(xì)胞壁進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi),與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物,干擾DNA聚合酶或RNA聚合酶的作用,阻礙DNA或RNA的合成,從而抑制微生物的繁殖.酚有使蛋白質(zhì)變性和損傷胞壁和質(zhì)膜的作用,是一類常用的抗菌劑和殺菌劑,但實(shí)驗(yàn)看出低濃度百里香酚乳液對(duì)綠膿桿菌抑制作用較差.表1中可以看出,殼聚糖-百里香酚復(fù)合物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和白色念珠菌的MIC均為0.5～0.125g/L,對(duì)表皮葡萄球菌、棒狀桿菌的MIC均為0.25～0.063g/L,比殼聚糖單體對(duì)白色念珠菌的MIC明顯降低,比百里香酚單體對(duì)表皮葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的MIC也明顯降低,說(shuō)明殼聚糖-百里香酚復(fù)合物具有良好的抑菌效果.2.2復(fù)合前后的抑菌活性和抑菌時(shí)間的確定殼聚糖、百里香酚及其復(fù)合物對(duì)不同菌的抑菌時(shí)間見(jiàn)表2.由表2可以看出,0.5g/L殼聚糖-0.125g/L百里香酚復(fù)合物對(duì)這6種菌都有明顯的抑制作用,但復(fù)合前殼聚糖不抑制白色念珠菌生長(zhǎng),百里香酚不抑制大腸桿菌和綠膿桿菌生長(zhǎng),說(shuō)明復(fù)合物的抑菌范圍變寬了.另一方面,從抑菌時(shí)間上來(lái)說(shuō),復(fù)合物對(duì)6種菌的抑菌時(shí)間比殼聚糖單體明顯地延長(zhǎng)了,對(duì)金黃色葡萄球菌、棒狀桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌的抑菌時(shí)間比百里香酚單體也有不同程度的延長(zhǎng).特別是對(duì)棒狀桿菌的抑菌時(shí)間超過(guò)134h.從抑菌范圍變寬和抑菌時(shí)間延長(zhǎng)可以看出,復(fù)合后的抑菌活性增強(qiáng)了,達(dá)到了復(fù)合抑菌劑的廣譜抗菌和增強(qiáng)抗菌效力的目的.2.3試驗(yàn)條件對(duì)化合物抗菌活性的影響2.3.1殼聚糖復(fù)合抑菌機(jī)制由表3可以看出,隨百里香酚濃度的降低,復(fù)合物對(duì)白色念珠菌的抑菌活性明顯降低;而隨殼聚糖濃度的降低,復(fù)合物對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌的抑菌活性消失,說(shuō)明復(fù)合物對(duì)白色念珠菌的抑制作用主要是因?yàn)榘倮锵惴?對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制作用主要是因?yàn)闅ぞ厶?總地說(shuō)來(lái),0.5g/L殼聚糖-0.125g/L百里香酚復(fù)合物對(duì)6種菌均有較長(zhǎng)的抑菌時(shí)間,特別是對(duì)棒狀桿菌超過(guò)134h,而0.5g/L殼聚糖-0.25g/L百里香酚復(fù)合物對(duì)5種細(xì)菌的抑菌時(shí)間都超過(guò)134h,對(duì)白色念珠菌在62h內(nèi)能完全抑制生長(zhǎng).說(shuō)明0.5g/L殼聚糖與0.125g/L或0.25g/L百里香酚復(fù)合有很好的抑菌效果.2.3.2g/l殼聚糖-0.5g/l百里香酚混合物對(duì)不同菌種和培養(yǎng)基由圖1可看出,隨著pH的升高,復(fù)合物的抑菌活性有不同程度的降低,一方面可能是因?yàn)闅ぞ厶鞘且环N弱堿性聚電解質(zhì),其分子中的—NH+3的pKa=6.2,高于此pH時(shí),殼聚糖溶解性差.另一方面可能是因?yàn)閺?fù)合物對(duì)不同菌種的抑菌作用不同,到pH5.8時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和白色念珠菌都無(wú)抑制作用,但到pH6.2時(shí)對(duì)表皮葡萄球菌和棒狀桿菌仍有抑制作用,到pH6.6時(shí)對(duì)棒狀桿菌還有抑制作用.說(shuō)明復(fù)合物對(duì)表皮葡萄球菌和棒狀桿菌的抑制作用較強(qiáng).結(jié)果表明0.5g/L殼聚糖-0.125g/L百里香酚復(fù)合物對(duì)棒狀桿菌,表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌具有抑菌效果的pH值范圍分別為4.6～6.6,4.6～6.2和4.6～5.4.2.3.3百里香酚乳液及混合物抑菌效果的比較不同乳化劑對(duì)百里香酚液及其復(fù)合物的抑菌活性有一定的影響,結(jié)果見(jiàn)表4.總地看來(lái),以吐溫-80作乳化劑所得百里香酚乳液及復(fù)合物的抑菌效果較司班-20好,特別是司班-20所得0.125g/L百里香酚乳液及其0.5g/L殼聚糖-0.125g/L百里香酚復(fù)合物對(duì)白色念珠菌均無(wú)抑制作用,而吐溫-80的有抑制作用.3殼聚糖復(fù)合抑菌活性人們?cè)谑褂没瘜W(xué)防腐劑的過(guò)程中,逐漸發(fā)現(xiàn)有不少化學(xué)防腐劑影響人體的健康,因此人們迫切需要開(kāi)發(fā)安全無(wú)毒的新型天然防腐劑,殼聚糖和百里香酚都屬于天然產(chǎn)物,也都具有一定的抑菌活性,有著很好的應(yīng)用前景.實(shí)驗(yàn)表明,0.5g/L殼聚糖-0.125g/L百里香酚復(fù)合物對(duì)6種菌都有明顯的抑制作用,但殼聚糖單體不抑制白色念珠菌生長(zhǎng),百里香酚單體不抑制大腸桿菌和綠膿桿菌生長(zhǎng).并且復(fù)合物對(duì)6種菌的抑菌時(shí)間比殼聚糖單體明顯地延長(zhǎng)了,對(duì)金黃色葡萄球菌、棒狀桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌的抑菌時(shí)間比百里香酚單體也有不同程度的延長(zhǎng),特別是對(duì)棒狀桿菌能完全抑制生長(zhǎng).說(shuō)明殼聚糖和百里香酚復(fù)合后明顯地提高了抑菌活性.實(shí)驗(yàn)條件對(duì)抑菌活性的影響表明0.5g/L殼聚糖-0.125g/L百里香酚復(fù)合物對(duì)6種菌均有較長(zhǎng)抑菌時(shí)間,特別是對(duì)棒狀桿菌的抑菌時(shí)間超過(guò)134h,而0.5g/L殼聚糖-0.25g/L百里香酚復(fù)合物對(duì)5種