花生殼膳食纖維低密度脂蛋白吸附劑的制備及性能研究

花生殼膳食纖維低密度脂蛋白吸附劑的制備及性能研究

1采用現(xiàn)用的治療方法隨著社會的發(fā)展，人們生活水平不斷提高，發(fā)病率高、脂肪性、肺動脈硬化的發(fā)病率也在增加，這嚴(yán)重危害了人類健康。臨床醫(yī)學(xué)表明，低密度脂肪酸（ldl）對膽固醇的運(yùn)輸起著重要作用，這與膽固醇代謝和動脈硬化之間的關(guān)系最大。目前使用藥物療法和飲食療法對該病的治療效果均不十分滿意,而采用血液灌流方法,通過吸附劑選擇性地去除血液中的低密度脂蛋白膽固醇來治療高脂血癥,是一種行之有效的、有很好前景的方法。傳統(tǒng)LDL吸附劑所選用的載體多種多樣,所采用的配基也較多。膳食纖維由于價廉、良好的反應(yīng)性及可再生性,被廣泛用于吸附劑載體材料。膳食纖維分子鏈上大量的羥基,使膳食纖維具有優(yōu)良的親水性和化學(xué)反應(yīng)性。膳食纖維通過羥基的功能基化反應(yīng),可以鍵連各種配基。且膳食纖維生物相容性良好,因此以膳食纖維為載體制成不同種膳食纖維衍生物,可進(jìn)行血液中的膽固醇吸附。本實(shí)驗(yàn)制備出一種新型雙親型低密度脂蛋白吸附劑,該吸附劑同時利用疏水作用和靜電作用對血漿中的膽固醇脂蛋白進(jìn)行吸附,可有效降低血漿中膽固醇含量,是一種新型的高效低密度脂蛋白吸附劑。2豬血漿中co和ldl-c含量的檢測2.1合成基本原理(見下頁化學(xué)反應(yīng)式)2.2試劑與儀器(1)主要試劑:花生殼膳食纖維,由本實(shí)驗(yàn)室自制;環(huán)氧氯丙烷(分析純),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;十二胺(分析純),飛翔化工有限公司;氯磺酸(分析純),上海亭新化工廠?；瘜W(xué)反應(yīng)式(2)主要儀器:721分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠;HH-2A恒溫水浴鍋,金壇市宏華儀器廠。2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1花生殼膳食纖維的活化將20g花生殼膳食纖維放入三口燒瓶中,加入100ml的環(huán)氧氯丙烷和3mol/L的NaOH溶液400ml,40℃水浴下反應(yīng)2.5h。將產(chǎn)品用無水乙醇和去離子水反復(fù)洗滌至中性,抽濾得活化產(chǎn)品。2.3.2活化膳食纖維的胺化20g已活化膳食纖維(濕態(tài))放入三口燒瓶中,加入30ml去離子水,然后加入20ml十二胺。將三口燒瓶放入70℃的恒溫水浴鍋中,在攪拌條件下,胺化反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后,冷卻、抽濾,并用乙醇和去離子水充分洗滌至中性。即得胺化膳食纖維產(chǎn)品。2.3.3磺化試劑的制備以甲酰胺為反應(yīng)介質(zhì),制備氯磺酸-甲酰胺磺化試劑。將100ml甲酰胺放入三口燒瓶中,置于冰鹽浴下。在攪拌條件下,滴加30ml的氯磺酸?？刂坡然撬岬牡渭铀俣?使反應(yīng)體系的溫度保持在5℃以下。滴加完畢后,得到白色黏稠液體,供磺化使用。2.3.4胺化膳食纖維的磺化將上述含磺化試劑的三口燒瓶放入60℃的恒溫水浴鍋中,加入10g胺化后的膳食纖維,在攪拌條件下進(jìn)行磺化反應(yīng),反應(yīng)時間為3h。反應(yīng)結(jié)束后,向反應(yīng)體系中加入適量去離子水,使充分溶解。將所得產(chǎn)品抽濾,充分洗滌至中性,即得最終產(chǎn)品。2.4吸附實(shí)驗(yàn)取少量新鮮豬血于離心試管中,3000r/min離心10min,抽取血漿,備用。吸附劑先用0.9%的生理鹽水充分浸泡24h溶脹后,用濾紙吸干其表面水分,溶脹度為16.5%。溶脹度=(Mw-Md)/Md式中:Mw為溶脹后濕態(tài)的質(zhì)量;Md為溶脹前干態(tài)的質(zhì)量。采用靜態(tài)吸附法。稱取一定量的吸附劑于三角燒瓶中,加入5ml豬血漿,于37℃下恒溫振蕩2.5h,離心分離,取上清液進(jìn)行測定。用生化實(shí)驗(yàn)方法測定吸附前后豬血漿中的TC、HDL-C和LDL-C的含量,LDL-C=TC-(HDL-C)。吸附率(A)由下式計(jì)算:A%=C0?C1C0×100%A%=C0-C1C0×100%式中:A為吸附率;C為血漿中TC,HDL-C、LDL-C的濃度;Co為吸附前濃度;C1為吸附后濃度。3結(jié)果與討論3.1反應(yīng)條件的確定3.1.1反應(yīng)時間及溫度當(dāng)固定反應(yīng)溫度為40℃,反應(yīng)時間為2h時,測定產(chǎn)品環(huán)氧值含量。NaOH濃度對環(huán)氧值含量的影響,如圖1(a)所示;當(dāng)NaOH濃度大于3mol/L,環(huán)氧值含量隨NaOH濃度的升高而降低。因此,NaOH濃度可選為3mol/L。當(dāng)固定反應(yīng)時間為2h,NaOH濃度為3mol/L時,當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到40℃,環(huán)氧值含量基本穩(wěn)定(見圖1(b))。當(dāng)固定反應(yīng)溫度為40℃,NaOH濃度為3mol/L,反應(yīng)時間大于2.5h時,環(huán)氧值含量隨時間的增大而減小(見圖1c))。因此,反應(yīng)時間確定為2.5h。3.1.2二胺用量對各合成纖維平均總膽固醇的吸附率的影響當(dāng)固定反應(yīng)溫度為60℃,反應(yīng)時間為4h,膳食纖維用量與十二胺用量比值(g/ml)為1∶1時,對3個血漿樣本的平均總膽固醇吸附率達(dá)到最大,如表1所示。當(dāng)固定十二胺用量,反應(yīng)時間為4h,反應(yīng)溫度達(dá)到70℃時,對3個血漿樣本的平均總膽固醇吸附率達(dá)到最高,如圖2(a)所示。當(dāng)固定十二胺用量,反應(yīng)溫度為70℃,反應(yīng)時間為4h時,對3個血漿樣本的平均總膽固醇吸附率達(dá)到最大,如圖2(b)所示。因此,在溫度為70℃,反應(yīng)時間為4h,膳食纖維和十二胺用量(g/ml)比值為1∶1時,所得胺化膳食纖維的紅外光譜圖顯示(見圖3a),在波數(shù)3450cm-1處有強(qiáng)吸收峰,表明有-OH基團(tuán)的O-H鍵和-NH-基團(tuán)的N-H鍵伸縮振動;在2960cm-1處有中強(qiáng)吸收,表明有-CH2或-CH3基團(tuán)的C-H伸縮振動;在2880cm-1處有中強(qiáng)吸收,表明有-CH2基團(tuán)的C-H鍵伸縮振動;在1662cm-1處有強(qiáng)吸收,表明有-NHCOCH基團(tuán)的C=O鍵的伸縮振動、非對稱伸縮振動和N-H鍵的彎曲振動;在1071cm-1處有強(qiáng)吸收,表明有C-O的伸縮振動和C-N的伸縮振動。3.1.3親水性膳食纖維的磺化反應(yīng)固定甲酰胺(10ml)及胺化膳食纖維(1g)用量,選取氯磺酸的用量(Vch)、反應(yīng)溫度(Reactiontemperature)、反應(yīng)時間(Reactiontime)三個因素,做正交實(shí)驗(yàn),測定產(chǎn)物對3個血漿樣本的平均總膽固醇吸附率,結(jié)果如表2所示。由表2可知,各影響因素中,氯磺酸用量影響最大,反應(yīng)溫度次之,反應(yīng)時間的影響因素最小。1g胺化膳食纖維的磺化,固定甲酰胺用量10ml,最佳磺化條件是A1B1C1,即氯磺酸用量3ml,反應(yīng)溫度60℃,反應(yīng)時間3h,得到雙親型膳食纖維吸附劑。其紅外光譜圖如圖3(b)所示。由雙親型膳食纖維吸附劑的紅外光譜可以看出,在波數(shù)3460cm-1處有強(qiáng)吸收峰,顯示有-OH基團(tuán)的O-H鍵和-NH-基團(tuán)的N-H鍵伸縮振動;在2940cm-1處有中強(qiáng)吸收,顯示有-CH2或-CH3基團(tuán)的C-H伸縮振動;在1730cm-1處有強(qiáng)吸收,顯示有-NHCOCH基團(tuán)的C=O鍵的伸縮振動、非對稱伸縮振動和N-H鍵的彎曲振動;在1170cm-1處有中強(qiáng)吸收,表明有SO32-基團(tuán)的S=O鍵伸縮振動;在1060cm-1處有強(qiáng)吸收,顯示有C-O的伸縮振動和C-N的伸縮振動。在831cm-1指紋區(qū)有吸收,表明有C-O-S鍵的伸縮振動。3.2血漿tc、hdl-c含量分別稱取0.05、0.1、0.15、0.2、0.3g吸附劑于三角燒瓶中,加入5ml的血漿,于38.5℃下恒溫振蕩2.5h,離心分離,取上清液測定吸附前后血漿中的TC、HDL-C的含量。對5個血漿樣本進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn),吸附結(jié)果如表3所示。由表3可知,當(dāng)雙親型吸附劑用量0.15g,血漿用量5ml時,其對TC和LDL-C的平均吸附率分別可達(dá)到49.9%和61.5%,而對HDL-C的吸附率為25.2%,表現(xiàn)出良好的選擇性。3.3低密度脂質(zhì)體吸附劑吸附機(jī)制稱取0.15g吸附劑于三角燒瓶中,加入5ml血漿,于38.5℃下恒溫振蕩2.5h,離心分離,取上清液測定吸附前后血漿中的TC、HDL-C的含量。對17個血漿樣本進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn),吸附結(jié)果如表4所示。目前,以纖維素為載體的低密度脂蛋白吸附劑,主要以膽固醇、氨基酸和磺酸基團(tuán)為配基,對低密度脂蛋白的吸附率達(dá)到56%。由表4可知,本實(shí)驗(yàn)研制的雙親型吸附劑對TC平均吸附率為40.8%,LDL-C平均吸附率為50.8%,HDL-C的平均吸附率為23.6%;具有良好的選擇性。由于雙親型膳食纖維吸附劑同時具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán),利用十二胺的碳鏈?zhǔn)杷饔煤突撬峄鶊F(tuán)的靜電作用,可對血漿中的膽固醇脂蛋白進(jìn)行吸附,對TC與LDL-C均有很高的吸附率,可顯著降低血漿TC和LDL-C水平。因?yàn)長DL與HDL表面堿性氨基酸殘基的差異,二者帶電量也有明顯不同。同HDL相比,LDL表面帶有大量正電荷基團(tuán)。根