小麥穗發(fā)芽抗性機制分析

小麥穗發(fā)芽抗性機制分析

在降雨條件下，小麥收獲初期的穗發(fā)芽，不僅降低了產量，而且影響了加工質量，失去了原材料和原產地的價值。一般紅粒小麥品種因休眠期較長比白粒品種具有較強的穗發(fā)芽抗性。絕大部分白粒小麥品種對穗發(fā)芽高度敏感,收獲期遇雨極易引起穗發(fā)芽,例如京、津、冀地區(qū)1995、2001、2008年穗發(fā)芽嚴重,造成巨大經濟損失。因此,目前穗發(fā)芽特別是白粒小麥穗發(fā)芽問題是我國乃至世界小麥育種急待解決的關鍵問題之一。穗發(fā)芽現象是基因與環(huán)境互作的結果,涉及眾多的影響因素。種子自身休眠特性是穗發(fā)芽的主要影響因素之一。小麥種子有3種類型的休眠機制,分別是種皮休眠、胚休眠(包括子葉作用和內源抑制物作用)及二者的綜合作用。品種的休眠期與穗發(fā)芽率呈極顯著負相關。另外,研究表明,穎殼中的發(fā)芽抑制物(如酚類物質)和胚乳中的發(fā)芽抑制物(如α-淀粉酶抑制蛋白)對抑制穗發(fā)芽也有重要作用。穗發(fā)芽的鑒定方法概括起來有3種,即種子發(fā)芽、整穗發(fā)芽和α-淀粉酶活性測定。種子發(fā)芽只能反映小麥籽粒的休眠情況,不能反映穗發(fā)芽總體抗性;整穗發(fā)芽可以鑒定出品種的綜合抗性;α-淀粉酶活性測定可以鑒定胚乳抑制物對穗發(fā)芽的影響。發(fā)掘與穗發(fā)芽抗性相關的分子標記是近年來國內外的重點研究領域之一。目前在普通小麥的21條染色體上均發(fā)現與穗發(fā)芽抗性(或休眠)相關的QTL位點,還有一些與穗發(fā)芽抗性相關的形態(tài)標記QTL被定位,如5AL上的B1及6BL上的B2位點所控制的芒的特性,2DL上的C位點控制的棒狀穗型,2B和2D位點控制的角質層和蠟質等。除了挖掘QTL外,功能標記的開發(fā)近年來倍受重視。Yang等利用普通小麥Vp-1基因的保守序列設計引物,開發(fā)出共顯性STS功能標記Vp1B3,在敏感品種中擴增出652bp的片段,其基因型為Vp-1Ba;在抗性品種中能擴增出845bp和569bp兩種片段,其基因型分別是Vp-1Bb和Vp-1Bc;品種的發(fā)芽指數GI與PCR擴增出的三種片段密切相關。Xia等在歐洲小麥品種中發(fā)現了Vp-1Bd基因型;Chang等在中國地方小麥品種中發(fā)現了另外2個新的變異型Vp-1Be和Vp-1Bf;與野生型相比,這5種變異類型均與低的GI值相關。張春利在克隆小麥ABA-8羥化酶基因TaCYP701A1全長時發(fā)現一個與休眠有關的新基因,命名為Dorm-B1,根據該基因在穗發(fā)芽抗感品種間的差異,開發(fā)出一個與抗穗發(fā)芽相關的共顯性STS功能標記,位于7BL染色體上,命名為Dorm-1。該標記在大多數抗穗發(fā)芽品種中擴增出606bp片段,而在絕大多數感穗發(fā)芽品種中擴增出468bp片段。本文利用共顯性標記Vp1B3、Vp1-b2和Dorm-1結合種子發(fā)芽法、整穗發(fā)芽法以及穎殼、芒和穗軸相結合的發(fā)芽方法,對本課題組近幾年篩選出的具有不同穗發(fā)芽抗性的白粒小麥品系進行穗發(fā)芽抗性的基因型和表型鑒定,以明確其穗發(fā)芽抗性機理和類型,為培育白粒抗穗發(fā)芽品種提供理論依據和親本材料。1材料和方法1.1麥品種系管理實驗于2008-2010年在中國農業(yè)科學院作物科學研究所中圃場試驗地進行。所用小麥品種(系)11份,詳見表2。雙行區(qū),行長2m,行距30cm,每行100粒。田間管理為底肥每667m2施二銨25kg,尿素10kg;拔節(jié)肥每667m2施尿素15kg。全生育期灌溉4次:冬水,返青水,拔節(jié)水,灌漿水。防治蚜蟲2～3次。1.2方法1.2.1穗發(fā)芽抗性材料與發(fā)芽試驗2008年北京市小麥收獲前遇到了9d的連陰雨天氣,穗發(fā)芽十分嚴重。本課題組中圃場試驗地親本圃中80份白粒材料以及2個紅粒對照(京9428和京冬8號)均未收獲,于田間自然降雨條件下進行整穗發(fā)芽鑒定,結合分子標記選出不同穗發(fā)芽抗性的材料共11份(表2)。隨后兩年在中圃場試驗地繼續(xù)對這11份材料進行穗發(fā)芽鑒定。2009年整穗發(fā)芽鑒定是在大部分小麥品種處于臘熟時,每品種選取25～30個成熟一致的主莖穗帶穗下節(jié)一起剪掉,在通風地方自然風干(約2d)。每個品種取5穗做整穗發(fā)芽試驗,剩余的麥穗進行其他發(fā)芽處理。整穗發(fā)芽試驗時將5個麥穗捆成一束,在水中浸泡10～12h后插入盛有沙子的塑料盒內,澆足水,用塑料布覆蓋,置于室溫下保濕。每天噴水一次,以增加濕度,5d后取出,統(tǒng)計發(fā)芽率。用手剝出籽粒,凡萌發(fā)或萌動者為發(fā)芽,反之為不發(fā)芽。整穗發(fā)芽率(%)=5穗的發(fā)芽粒數/總粒數×100%2010年整穗發(fā)芽鑒定是在大部分小麥品種黃熟后取穗鑒定,方法與2009年相同。1.2.2發(fā)芽率的測定2009和2010年籽粒及其他發(fā)芽方法所用材料是除去整穗發(fā)芽方法用掉的5穗后剩余的20～25個麥穗,手工脫粒,在培養(yǎng)皿中做發(fā)芽試驗,分為5種處理,均在室溫下進行。(1)籽粒發(fā)芽:每品種取3～4個穗,手工脫粒后取100粒,置于有吸水紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽。(2)籽粒+芒發(fā)芽:先將每個品種3～4個穗的麥芒剪掉,收集起來,再進行手工脫粒,將100個籽粒和麥芒一起放入培養(yǎng)皿中發(fā)芽。(3)籽粒+穗軸發(fā)芽:先將每個品種3～4個穗進行手工脫粒,將穗軸剪成小段和100個籽粒一起放入培養(yǎng)皿中發(fā)芽。(4)籽粒+穎殼發(fā)芽:先將每個品種3～4個穗剪掉麥芒,再進行手工脫粒,再去掉穗軸,收集穎殼和100個籽粒一起放入培養(yǎng)皿中發(fā)芽。(5)籽粒+全(包括麥芒、穗軸和穎殼)發(fā)芽:對每個品種3～4個穗進行手工脫粒,收集芒、穗軸、穎殼和100個籽粒一起放入培養(yǎng)皿中發(fā)芽,7d后進行發(fā)芽率統(tǒng)計。發(fā)芽率(%)=發(fā)芽粒數/100×100%1.2.3沉淀-異戊醇-1每品種(系)選取飽滿、整齊的籽粒3粒,機械粉碎至粉末狀,裝入2.0mL離心管中;加0.9mL提取液(Tris-HCl200mmol·L-1,pH8.0;EDTA25mmol·L-1pH8.0;NaCl288mmol·L-1;0.5%SDS),充分混勻,65℃水浴30～60min,并不時搖動;加入等體積的酚/氯仿(1∶1),輕搖5～10min;4℃,12000r/min離心10min;轉移上清到另一無菌1.5mL離心管中,加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1),輕輕顛倒離心管數次,靜置幾分鐘后,于4℃,12000r/min離心10min;轉移上清到另一無菌1.5mL離心管中,加入0.6倍體積的異丙醇,輕搖混勻,-20℃沉淀1h以上;4℃,12000r/min離心10min;棄上清,將沉淀物用70%乙醇洗滌2次;4℃,12000r/min,離心5min;棄上清,自然干燥1.5h以上,加入適量的TE溶解DNA。1.2.4引物合成及pcr擴增按照Yang等、Chang等和張春利開發(fā)的STS標記Vp1B3、Vp1-b2和Dorm-1的引物序列合成引物,并參照他們的實驗方法進行PCR擴增和電泳分離。其引物序列、退伙溫度、擴增片斷大小和相應基因型見表1。2京冬8號不同品種穗發(fā)芽發(fā)芽率各基因型的發(fā)芽率用Vp1B3和Vp1-b2兩種功能標記對11個參試品種進行檢測,二者結果一致。僅檢測出Vp-1Ba、Vp-1Bb和Vp-1Bc三種基因型,未發(fā)現Vp-1Bd、Vp-1Be和Vp-1Bf類型(表2)。對照品種京9428和京冬8號是與抗穗發(fā)芽相關的Vp-1Bc基因型,Dorm-1標記為486bp,與感穗發(fā)芽相關。京9428具有很強的穗發(fā)芽抗性,三年整穗發(fā)芽率分別為1.0%、1.5%和6.2%,平均為2.9%;2009年籽粒發(fā)芽率為19.0%,而籽粒+芒、籽粒+穗軸、籽粒+穎殼和籽粒+全4個處理的發(fā)芽率分別為1.0%、5.0%、2.0%和1.0%,明顯低于籽粒發(fā)芽率;2010年僅有籽粒+穎殼和籽粒+全2個處理的發(fā)芽率明顯低于籽粒發(fā)芽率。以上結果表明,京9428的穗發(fā)芽抗性不僅受粒色和Vp-1Bc基因控制,而且與穎殼抑制物有關。對照京冬8號具有中等穗發(fā)芽抗性,三年整穗發(fā)芽率分別為24.3%、29.2%和30.1%,平均為27.9%;2009年籽粒發(fā)芽率為36.0%,籽粒+芒和籽粒+穗軸發(fā)芽率分別為32.0%和30.0%,與籽粒發(fā)芽率接近,而僅籽粒+穎殼和籽粒+全2個處理的發(fā)芽率為3.0%,明顯低于籽粒發(fā)芽率;2010年得到類似結果。表明京冬8號的穗發(fā)芽抗性由粒色、Vp-1Bc基因和穎殼抑制物共同控制。為了便于分析,依據兩個對照品種京9428和京冬8號以及白粒最高發(fā)芽率品種CA0306的平均整穗發(fā)芽率,我們將9個白粒品種穗發(fā)芽分為四類:凡平均整穗發(fā)芽率與京9428接近者為強抗穗發(fā)芽型;與京冬8號接近者為中抗穗發(fā)芽型;與CA0306接近者為高感穗發(fā)芽型;介于京冬8號和CA0306之間偏向京冬8號者為中感穗發(fā)芽型。第一類強抗穗發(fā)芽型,包括CA0431和山東046432。平均整穗發(fā)芽率為8.3%和8.0%,比強抗穗發(fā)芽對照京9428發(fā)芽率高約5個百分點。CA0431為感穗發(fā)芽Vp-1Ba基因型,Dorm-1分子標記檢測結果486bp,為感穗發(fā)芽類型片段;山東046432是Vp-1Bc基因型和Dorm-1的606bp片段,均與抗穗發(fā)芽相關。兩個品系2009年各種處理發(fā)芽率差異不大,但2010年籽粒發(fā)芽率與其他5個處理發(fā)芽率存在較大差異,其中籽粒+芒、籽粒+穎殼、籽粒+全和整穗發(fā)芽率明顯低于籽粒發(fā)芽率。表明CA0431和山東046432的穗發(fā)芽抗性與芒和穎殼或它們的分泌物有關。2009～2010兩年CA0431的籽粒發(fā)芽率為1.0%和47.5%,第一年比兩個紅粒抗穗發(fā)芽對照低,第二年介于二者之間。因此,還有其他遺傳因素控制其穗發(fā)芽,需要進一步研究。第二類為中抗穗發(fā)芽型,包括矮抗58和CA9550-2,三年平均整穗發(fā)芽率為16.9%和20.5%,較紅粒中抗對照京冬8號整穗發(fā)芽率(27.9%)低。矮抗58為Vp-1Ba基因型,Dorm-1標記為486bp,均與感穗發(fā)芽相關。2009年和2010年籽粒發(fā)芽率分別為16.0%和32.0%,均明顯高于籽粒+芒、籽粒+穗軸、籽粒+穎殼和籽粒+全4個處理。表明矮抗58的穗發(fā)芽抗性與芒、穗軸和穎殼或它們的分泌物有關。CA9550-2是與強抗穗發(fā)芽相關的Vp-1Bb基因型;Dorm-1分子標記檢測結果與感穗發(fā)芽相關;2009年和2010年其籽粒發(fā)芽率均明顯高于籽粒+芒、籽粒+穎殼和籽粒+全3個處理,與籽粒+穗軸處理發(fā)芽率接近。表明芒和穎殼或它們的分泌物對穗發(fā)芽有一定的抑制作用,但籽粒發(fā)芽率兩年差異很大(分別為9.0%和80.0%),Vp-1Bb基因是否抑制CA9550-2的穗發(fā)芽還需進一步研究證實。第三類為中感穗發(fā)芽型,包括CA9640、CA0459和CA0493三個品系,其平均整穗發(fā)芽率分別為41.7%、48.9%和56.8%。這3個中感穗發(fā)芽材料經Vp1B3和Dorm-1標記檢測均與感穗發(fā)芽相關。兩年的籽粒發(fā)芽率均明顯高于籽粒+芒、籽粒+穎殼和籽粒+全3個處理的發(fā)芽率,而與處理籽粒+穗軸的發(fā)芽率比較接近,表明芒和穎殼或它們的分泌物對CA9640、CA0459和CA0493的穗發(fā)芽有一定的抑制作用,穗軸作用較小或無作用。第四類為高感穗發(fā)芽型,包括山東928802和CA0306,平均整穗發(fā)芽率為63.0%和86.6%,分別屬于Vp-1Bb、Vp-1Bc基因型,均與抗穗發(fā)芽相關。但它們兩年的籽粒發(fā)芽率均很高,山東928802分別為93.0%和80.0%;CA0306分別為94.9%和96.0%,均為高感穗發(fā)芽,Vp-1Bb、Vp-1Bc基因并未對發(fā)芽起抑制作用。兩年的籽粒發(fā)芽率明顯高于處理籽粒+穎殼和籽粒+全,也高于處理籽粒+芒,與2009年處理籽粒+穗軸有差異,而與2010年處理籽粒+穗軸無差異。3討論3.1灌漿期發(fā)芽率比較張海峰等研究表明,品種的成熟度對穗發(fā)芽率有顯著影響,我們的試驗結果也證實了這一點。2010年11個品種的平均籽粒發(fā)芽率、處理籽粒+芒、籽粒+軸、籽粒+殼和籽粒+全的發(fā)芽率均高于2009年,是2009年相應值的2～6倍(表2)。除山東928802籽粒發(fā)芽率外,2010年每個品種的這5種處理發(fā)芽率均比2009年高。除兩年灌漿后期的氣候因素不同外,成熟度的不同很可能是兩年差異的主要原因。2009年是在大部分材料處于臘熟期取穗鑒定,而2010年是在絕大部分材料完熟后取穗鑒定。如CA9550-2、京冬8號、CA0459和CA04932在2009年籽粒發(fā)芽率依次為9.0%、36.0%、19.0%和22.0%,屬于抗穗發(fā)芽型;而2010年籽粒發(fā)芽率分別為80.0%、71.0%、96.5%和95.5%,則屬于感穗發(fā)芽類型。但三年11個品種的平均整穗發(fā)芽率分別為30.3%、33.9%和39.0%,差異并不太大。除CA9550-2外,同一品種不同年份整穗發(fā)芽率差異明顯比籽粒發(fā)芽率差異小。京冬8號三年整穗發(fā)芽率接近,均為中抗類型;CA0459和CA0493三年整穗發(fā)芽率接近,均為中感類型。因此,在實際育種工作中,如果僅用籽粒發(fā)芽一個指標進行穗發(fā)芽篩選時有可能出現誤判。3.2小麥品種的檢測整穗發(fā)芽試驗能較好反映小麥穗發(fā)芽的綜合抗性,其鑒定結果也符合生產實際。但影響穗發(fā)芽的因素較多,除種子休眠外,還有α-淀粉酶、穗部結構及種皮顏色、穎殼抑制物等諸多因素影響。如果僅依靠整穗發(fā)芽對小麥的穗發(fā)芽抗性進行鑒定,則不能全面了解抗穗發(fā)芽的機理。本研究利用與穗發(fā)芽相關的共顯性STS標記Vp1B3、Vp1-b2和Dorm-1,結合整穗、籽粒及籽粒+穎殼等不同發(fā)芽處理,研究了穗發(fā)芽抗性機理。Yang等研究表明,一般感穗發(fā)芽品種為Vp-1Ba基因型,抗穗發(fā)芽品種是Vp-1Bb和Vp-1Bc基因型。本試驗中的京9428、山東046432和京冬8號均是Vp-1Bc基因型,它們具有強或較強的穗發(fā)芽抗性;CA0306為Vp-1Bc基因型,但嚴重感穗發(fā)芽。CA9550-2和山東92880是Vp-1Bb基因型,前者是中抗穗發(fā)芽,后者為高感穗發(fā)芽。因此,并非所有Vp-1Bb和Vp-1Bc基因型的品種均抗穗發(fā)芽,其原因還需進一步研究。這也反映了小麥穗發(fā)芽是一個受多種因素控制的性狀,其抗性機理比較復雜。張春利開發(fā)了位于7BL染色體上與抗穗發(fā)芽相關的共顯性STS功能標記Dorm-1,在104份白粒小麥材料中可擴增出468bp和606bp兩類帶型,這兩類條帶與品種的穗發(fā)芽指數存在極顯著,認為該標記可用于穗發(fā)芽分子標記輔助育種。本研究中僅山東046432可擴增出606bp片段,而且具有很