海洋細(xì)菌hy-1的分離鑒定及抗金黃色葡萄球菌的分子鑒定

海洋細(xì)菌hy-1的分離鑒定及抗金黃色葡萄球菌的分子鑒定

材料和方法1材料表面1.1海泥樣品采集自煙臺(tái)第一個(gè)海濱浴場(chǎng)附近。1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株標(biāo)準(zhǔn)株金黃葡萄球菌和大腸埃希菌為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種;MRSA為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈(zèng)予。1.3細(xì)菌基因組dna提取rTaq聚合酶、dNTP、pMD-18T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自大連寶生物制品有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.4pcrDYY-ZC型電泳儀,購(gòu)于北京市六一儀器廠;自動(dòng)CCD凝膠成像系統(tǒng),購(gòu)于天能科技有限公司;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,購(gòu)于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;BS-2F振蕩培養(yǎng)箱,購(gòu)于國(guó)華電器有限公司;9600型PCR擴(kuò)增儀,為美國(guó)PekinElmer公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F型),購(gòu)于濟(jì)南綠之潔科技有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),購(gòu)于北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。1.5響應(yīng)面樹(shù)高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基,含2.0%可溶性淀粉、0.1%KNO3、0.05%NaCl、0.05%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.001%FeSO4、1.5%瓊脂,pH7.2～7.4。LB培養(yǎng)基:含1%蛋白胨,0.5%酵母膏,1%NaCl,固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂,121℃滅菌20min。2方法2.1混懸液的稀釋和濃度的配制取采自不同地點(diǎn)的海泥樣品各1g,加無(wú)菌水10ml,充分振蕩混勻,使成10倍稀釋的混懸液(0.1g/ml)。取上述樣品混懸液1ml,用9ml無(wú)菌水稀釋,使成100倍稀釋的混懸液(0.01g/ml)。上述兩種混懸液各吸取200μl,分別均勻涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)3～9d。培養(yǎng)過(guò)程中每天觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況,待菌落形成后適時(shí)挑取形態(tài)不同的單菌落,劃線接種于新的平板培養(yǎng)基上,繼續(xù)在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并從中再次挑取單菌落劃線培養(yǎng),直至分離得到純菌株,命名HY-1。2.2實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的革蘭顯微觀察對(duì)分離純化得到的菌株先后接種高氏一號(hào)和LB固體培養(yǎng)基,分別于28℃培養(yǎng)3～7d和37℃培養(yǎng)1～2d,革蘭染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。2.3受試菌的篩選將純化得到的菌株進(jìn)行抗菌譜的測(cè)定。抑菌試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法,分別采用劃線接種法和混合倒平板法,受試菌分別為金黃葡萄球菌、大腸埃希菌和MRSA。37℃培養(yǎng)1～2d觀察結(jié)果。2.41srdna分析將細(xì)菌HY-1接種在平板上,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。取單一菌落接種于4mlLB培養(yǎng)基中,采用索萊寶公司試劑盒提取細(xì)菌基因組。PCR擴(kuò)增的正向引物16SrDNAF:5′-CGGCGTGCCTAATACATGCAAG-3′;反向引物16SrDNAR:5′-GGCATGCTGATCCGCGATTACTA-3′(引物由上海博尚生物技術(shù)公司合成)。50μlPCR反應(yīng)體系:模板1μl,2×mix25μl,16srDNAF3μl,16SrDNAR3μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性6min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸80s,共30個(gè)循環(huán);最后72℃溫育10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用GelExtractionKit試劑盒DNA純化系統(tǒng)回收,交由上海美吉工程技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序后的16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)。選取同源性較高(>97%)的16SrDNA基因序列作為參比對(duì)象,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用ClustalX1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì),然后采用鄰位相接法(Neighbour-joining)和利用MEGA3.1軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果1培養(yǎng)基的生長(zhǎng)在分離培養(yǎng)過(guò)程中,HY-1菌株對(duì)其他菌株有抑制作用(圖1)。純培養(yǎng)菌能分解淀粉,菌落周?chē)忻黠@的溶淀粉圈。在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7d,菌落生長(zhǎng)緩慢,稀疏,較小,白色半透明,表面光滑,邊緣不整齊,似雪花狀;在LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)2d,菌落生長(zhǎng)快速,鋪滿整個(gè)平板,表面光滑,有突起,粘稠,乳黃色,邊緣不整齊,直徑約為1～2mm。該菌革蘭染色陽(yáng)性,桿狀,產(chǎn)芽胞,芽胞位于中央或偏向一側(cè),小于菌體,似炭疽桿菌。2抑菌活性活性采用紙片法測(cè)定HY-1菌株對(duì)金黃葡萄球菌、大腸埃希菌、MRSA的抑菌活性。其中對(duì)金黃葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用(圖2),對(duì)大腸埃希菌和MRSA的抑制作用較弱。316細(xì)菌基因組檢測(cè)挑取純培養(yǎng)的單一菌落HY-1培養(yǎng)過(guò)夜,提取細(xì)菌基因組,以特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收、純化16SrDNA,1%瓊脂糖電泳檢測(cè)其大小為1254bp(圖3)。416srdna分析HY-1菌株的16SrDNA序列提交GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù),GenBank號(hào)為JN851704。為進(jìn)一步確定該海洋細(xì)菌的分類(lèi)地位,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST,選取相關(guān)的14個(gè)細(xì)菌的16SrDNA的序列結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)關(guān)系分析,用MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)(圖4)。經(jīng)過(guò)同源性分析,HY-1與蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌聚成一枝,同源性達(dá)100%,與枯草芽胞桿菌和短小芽胞桿菌的相似度為98%。綜合HY-1的形態(tài)、生理生化特征和16SrDNA的序列結(jié)果,將HY-1鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)。關(guān)于海洋細(xì)菌的活性成分自從1966年第一株有抑菌作用的海洋細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)以來(lái),越來(lái)越多的具有抑菌活性的細(xì)菌被分離出來(lái)。目前已報(bào)道的這類(lèi)海洋細(xì)菌主要有假單胞菌(Pseudomonas),交替單胞菌(Alteromonas),弧菌屬(Vibrio),螺菌屬(Spirillum),玫瑰桿菌(Roseobacter),光合細(xì)菌(Photosynbacter),藤黃微球菌(Micrococcusleteus),煙草節(jié)桿菌(Arthrobacternicotiana)等。徐長(zhǎng)安等篩選到1株海洋芽胞桿菌對(duì)鰻弧菌有較強(qiáng)的致病作用,并應(yīng)用于海水養(yǎng)殖中。李淑彬等從大亞灣海底沉積物中分離到1株具有廣譜抗真菌活性的曲霉,該菌對(duì)多種酵母菌、皮膚感染菌均具有強(qiáng)烈的抑制活性。呂家森從海洋微生物中分離到多株對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用的海洋細(xì)菌。本研究從海泥篩選到1株對(duì)金黃葡萄球菌有較強(qiáng)抑制活性的海洋細(xì)菌HY-1。該菌在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢,菌落小,雪花狀,而在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快速,菌落較大。常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法檢測(cè)該細(xì)菌為革蘭染色陽(yáng)性桿菌,產(chǎn)芽胞,能溶解淀粉,具有芽胞桿菌屬的特征。該菌對(duì)金黃葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用,而對(duì)大腸埃希菌和MRSA作用甚微。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上看,該細(xì)菌與芽胞桿菌屬的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌同源性最高。與其他芽胞桿菌如枯草芽胞桿菌相似性也較高,而與居藻芽胞桿菌(Bacillusalgicola)相似度較所列出的其他芽胞桿菌相似度低。本研究從形態(tài)、生理生化、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、16SrDNA序列同源性等方面分析,將菌株HY-1鑒定為蠟樣芽胞桿菌,并證明該菌對(duì)致病性金黃葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性,為深入研究其抗菌譜及篩選產(chǎn)生抗生素的新型海洋微生物奠定了基礎(chǔ)。海洋微生物次生代謝產(chǎn)物是新穎結(jié)構(gòu)和活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源,也是抗菌藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉。作者分別從煙臺(tái)第一海水浴場(chǎng)近海海水、海泥以及煙臺(tái)大學(xué)近海海水中篩選具有抗菌活性的菌株,采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定樣品的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)純化的來(lái)自于海泥樣品的細(xì)菌對(duì)金黃葡萄球菌具有較好的抑菌作用。本研究進(jìn)一步對(duì)該菌株的形態(tài)、生理生化、16SrDNA序列同源性、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)進(jìn)行分析比較,以期確定其分類(lèi)地位。***金黃葡萄球菌是一種危害嚴(yán)重的機(jī)