CCAA團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)草案編制說明-杯狀病毒

CCAA團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)草案編制說明基本信息標(biāo)準(zhǔn)草案名稱中文水體中杯狀病毒檢測方法實(shí)時熒光RT-PCR法英文Amethodfordeterminationofcalicivirusinwater---real-timeRT-PCR項目類型√制定□修訂（被修訂標(biāo)準(zhǔn)名稱及編號：）計劃編號2022TB036起止時間2022年11月---2023年10月標(biāo)準(zhǔn)起草單位北京美正生物科技有限公司、中華人民共和國大連海關(guān)、中國合格評定國家認(rèn)可中心、本溪市動物疫病預(yù)防控制中心、拱北海關(guān)技術(shù)中心、浙江諾威檢測認(rèn)證有限公司、國檢測試控股集團(tuán)遼寧有限公司。起草組成員劉磊、徐娜、白慶華、王志強(qiáng)、姚麗鋒、周傲白雪、麻麗丹、陶文靖、盛琳、陸嘉誠、崔亞麗、楊希國、李麗、劉石鑫。項目調(diào)整情況無背景、目的和意義背景水體的安全問題目前已經(jīng)受到了人們的廣泛關(guān)注，腸道病毒的水源性爆發(fā)是一項重大的公共衛(wèi)生問題，例如人們生活中的飲用水、食品生產(chǎn)加工用水、水產(chǎn)養(yǎng)殖用水、污水等，這些水如果受到病毒污染，則會給人們的健康帶來極大危害。腸道病毒來源廣，傳播途徑多樣，其中杯狀病毒的環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，能在自然環(huán)境水體中存活很長時間，是對人類健康影響較大的污染物，已經(jīng)導(dǎo)致了多起大規(guī)模的疾病爆發(fā)，引起了人們的廣泛關(guān)注。杯狀病毒科（Caliciviridae）為無囊膜的單股正鏈RNA病毒，包含許多對人類和動物健康帶來嚴(yán)重威脅的病毒成員。其中五個病毒屬是由感染哺乳動物的病毒所組成，包括水皰性病毒屬（Vesivirus）、兔病毒屬（Lagovirus）、杯狀病毒屬（Norovirus）、札幌病毒屬（Sapovirus）、內(nèi)博病毒屬（Nebovirus）。杯狀病毒是引起兒童和成人非細(xì)菌性胃腸炎的主要病原之一，常在醫(yī)院、餐館、學(xué)校、托兒所、孤兒院、養(yǎng)老院、軍隊、家庭及其他人群中引起暴發(fā)。其中杯狀病毒流行大多源于某種食物或水的污染，再因人傳人而發(fā)展，故預(yù)防措施需全面著手。目前，杯狀病毒主要的檢驗方法為電鏡法、免疫法、PCR法，其中PCR方法為主流方法，但由于環(huán)境樣本中病毒含量非常低，病毒的檢測非常困難，鑒于此，需要提高杯狀病毒的富集效果以及檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，建立一種簡便易操作的水體中杯狀病毒檢測方法，對水體中杯狀病毒污染水平實(shí)現(xiàn)有效監(jiān)控。目的本標(biāo)準(zhǔn)建立“水體中杯狀病毒檢測方法實(shí)時熒光RT-PCR法”體系，包括采用陽離子膜富集小體積水和超濾方法及裝置對大體積水富集回收操作，以及杯狀病毒實(shí)時熒光RT-PCR法。意義通過制定此項標(biāo)準(zhǔn)填補(bǔ)我國標(biāo)準(zhǔn)上的空白，為水體中杯狀病毒的富集和檢測提供前沿、高效方法。工作簡況標(biāo)準(zhǔn)主要起草人任務(wù)分工劉磊、徐娜、白慶華、王志強(qiáng)、姚麗鋒、周傲白雪、麻麗丹、陶文靖：對方法涉及的儀器、耗材、試劑等要求給出明確規(guī)定；對病毒富集及檢測操作流程（濃縮、洗脫、核酸提取、檢測等）給出明確規(guī)定；病毒富集、RT-PCR反應(yīng)涉及的參數(shù)給出明確規(guī)定；對實(shí)時熒光RT-PCR結(jié)果判讀和分析給出明確規(guī)定；起草標(biāo)準(zhǔn)文本。盛琳、陸嘉誠、崔亞麗、楊希國、李麗、劉石鑫：方法實(shí)驗室內(nèi)驗證和重復(fù)性實(shí)驗。主要工作過程1.分工情況標(biāo)準(zhǔn)起草組織工作由北京美正生物科技有限公司牽頭負(fù)責(zé)，主要工作為收集整理國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)資料；制定方法驗證方案、負(fù)責(zé)檢測方法優(yōu)化建立與驗證、樣品檢驗結(jié)果分析；組織標(biāo)準(zhǔn)起草及實(shí)驗室方法可行性驗證，撰寫標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明。2.起草階段2022.11-2023.10：方法驗證和起草征求意見稿；3.征求意見階段2023.11：征集意見和制定標(biāo)準(zhǔn)文本；4.標(biāo)準(zhǔn)審定階段2023.12：標(biāo)準(zhǔn)評審和報送材料。標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù)標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)為首次制定，以科學(xué)的實(shí)驗數(shù)據(jù)為依據(jù)，經(jīng)過科學(xué)研究而制定。本標(biāo)準(zhǔn)旨在利用實(shí)時熒光RT-PCR法實(shí)現(xiàn)水體中杯狀病毒的快速定性檢測。本標(biāo)準(zhǔn)不僅是SN/T4784-2017《出口食品中杯狀病毒和甲肝病毒檢測方法實(shí)時RT-PCR方法

》和DB45/T2138-2020《水體中杯狀病毒的核酸檢測方法實(shí)時熒光RT-PCR法》的有效補(bǔ)充，同時對其進(jìn)行了改進(jìn)。在簡化水樣病毒富集處理的同時，保證了測試的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性，能快速測定水體中的杯狀病毒，提供了一種準(zhǔn)確快速的檢測方法，具有廣泛的適用性。同時，本方法在編制過程中引入第三方實(shí)驗室對本標(biāo)準(zhǔn)所列方法進(jìn)行驗證和評價，具有先進(jìn)性、科學(xué)性、合理性和可操作性。確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù)標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容包括兩部分，一部分為水體中杯狀病毒檢測，需要驗證方法的檢出限和重復(fù)性；另外一部分需要驗證CS1000plus水體自動采樣富集一體機(jī)用于水體中MS2過程控制病毒的濃縮富集回收效果，從而驗證在水體樣品檢測杯狀病毒中應(yīng)用的適用性，包括MS2的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，MS2添加到不同水體樣品中的回收率。1、方法的檢出限每份樣本加入50μL杯狀病毒質(zhì)控品的稀釋液,相當(dāng)于300基因拷貝/500mL瓶裝水樣本,結(jié)果見下表1。表1水中杯狀病毒的檢出限樣品編號杯狀病毒加入量（基因拷貝/500mL瓶裝水樣本）Ct值結(jié)果判定130038.667陽性230037.804陽性330038.237陽性430040.419陰性530038.074陽性630039.058陽性730038.112陽性830037.567陽性930038.091陽性1030038.453陽性方法的重復(fù)性驗證制備樣本陰性樣本：不添加任何杯狀病毒的水樣本。高水平添加樣本：500mL水樣品中加入600個基因拷貝的杯狀病毒（每份樣本加入100μL杯狀病毒質(zhì)控品的一萬倍稀釋液,相當(dāng)于600個基因拷貝/500mL瓶裝水樣本）。驗證結(jié)果見下表2。表2水中杯狀病毒檢測方法的重復(fù)性（30個樣品）樣本分組樣本編號添加水平（基因拷貝/500mL）Ct值結(jié)果判定第一組110/陰性1230038.12陽性1360037.04陽性第二組140/1530037.98陽性1660035.65陽性第三組170/陰性1830038.65陽性1960036.34陽性第四組200/陰性2130039.22陽性2260035.87陽性第五組230/陰性24300/陰性2560037.02陽性第六組260/陰性2730038.53陽性2860036.98陽性第七組290/陰性30300/陰性3160036.55陽性第八組320/陰性3330037.80陽性3460036.23陽性第九組350/陰性3630038.05陽性3760036.76陽性第十組380/陰性39300/陰性4060035.33陽性水體自動采樣富集一體機(jī)富集水體樣本中MS2適用性及回收率驗證MS2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備結(jié)果見下表3表3方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度MS2原液MS2101×稀釋液MS2102×稀釋液MS2103×稀釋液MS2104×稀釋液Ct值22.54325.69729.32232.89136.863標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.5834x+22.296相關(guān)系數(shù)r＝-0.9994水體樣本中MS2回收率驗證實(shí)驗取10μLMS2添加到不同的水體樣品中，每種類水體樣品做10個樣本。飲用瓶裝水中MS2的回收率實(shí)驗見下表4表4飲用瓶裝水樣本MS2的回收率實(shí)驗（10個樣品）樣品名稱MS2本底值MS2添加量MS2實(shí)測值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%瓶裝水010μL30.95530.67%32.00%16.72%30.89631.85%31.17826.57%31.09827.97%30.96530.47%30.49041.35%31.31624.32%30.89531.87%30.68436.50%30.60438.43%灘涂養(yǎng)殖海水中MS2的回收率實(shí)驗見下表5表5灘涂養(yǎng)殖海水樣本MS2的回收率實(shí)驗（10個樣品）樣品名稱MS2本底值MS2添加量MS2實(shí)測值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%灘涂養(yǎng)殖海水010μL30.58238.97%30.52%19.13%31.35123.78%31.19726.25%30.8732.39%30.90431.69%30.69136.34%30.61738.11%31.24525.45%31.3523.79%31.07428.41%醫(yī)療污水樣本中MS2的回收率實(shí)驗見下表6表6醫(yī)療污水樣本MS2的回收率實(shí)驗（10個樣品）樣品名稱MS2本底值MS2添加量MS2實(shí)測值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%醫(yī)療污水010μL31.70918.89%22.08%35.62%31.94616.22%31.36223.61%30.97430.29%31.73518.58%31.75418.35%32.49211.42%30.75534.87%31.94316.25%30.87232.35%生產(chǎn)用井水樣本MS2的回收率實(shí)驗見下表7表7生產(chǎn)用井水樣本MS2的回收率實(shí)驗（10個樣品）樣品名稱MS2本底值MS2添加量MS2實(shí)測值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%生產(chǎn)用井水010μL31.30324.52%31.78%21.35%31.14327.18%30.66636.92%31.11827.62%31.45522.24%30.96730.43%30.77234.49%30.90731.63%30.58438.92%30.39943.84%生產(chǎn)灌溉水樣本MS2的回收率實(shí)驗見下表8表8生產(chǎn)灌溉水樣本MS2的回收率實(shí)驗（10個樣品）樣品名稱MS2本底值MS2添加量MS2實(shí)測值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%生產(chǎn)灌溉水010μL30.79134.08%32.53%24.64%31.21226.00%30.68236.55%31.24625.44%31.11827.62%30.56139.50%31.1327.41%30.90731.63%30.17350.69%31.18726.42%現(xiàn)行法律法規(guī)、強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)和其他有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)與相關(guān)法律法規(guī)、強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)保持一致性，不矛盾、不抵觸。與其他有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)：推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：SN/T4784-2017推薦性地方標(biāo)準(zhǔn)：DB45/T2138-2020國際標(biāo)準(zhǔn)和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)：ISO15216-1:2019SN/T4784-2017和ISO15216-1:2019這兩個標(biāo)準(zhǔn)只適用于瓶裝水中杯狀病毒檢測。該方法使用膜吸附-洗脫-濃縮陽離子膜-TGBE-超濾管過濾，對污水、生活用水、生產(chǎn)用水、地下水、集中式供水、娛樂用水、醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水等中杯狀病毒進(jìn)行檢測。DB45/T2138-2020《水體中諾如病毒的核酸檢測方法實(shí)時熒光RT-PCR法》，適應(yīng)于廣西區(qū)域內(nèi)地表水、地下水、集中式供水、娛樂用水、污水等水體基質(zhì)中諾如病毒的核酸檢測。重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)無貫徹該標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議本方法利用實(shí)時熒光RT-PCR法實(shí)現(xiàn)水體中杯狀病毒的快速定性檢測。本方法適用于污水、生活用水、生產(chǎn)用水、地下水、集中式供水、娛樂用水、醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水等中杯狀病毒進(jìn)行檢測。由于現(xiàn)行行標(biāo)SN/T4784-2017（出口食品中杯狀病毒和杯狀病