硫酸銅對蠶豆根尖細(xì)胞遺傳毒性效應(yīng)研究

硫酸銅對蠶豆根尖細(xì)胞遺傳毒性效應(yīng)研究

隨著工業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，以及礦產(chǎn)的開發(fā)利用，重金屬污染日益突出。許多研究表明鋁、砷對動、植物具有明顯的致突、致畸效應(yīng)。銅是動、植物生長所必需的一種微量元素。硫酸銅是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的殺菌、殺藻劑,且硫酸銅可用于防治魚類小瓜蟲病、魚類纖毛蟲病、鞭毛蟲病等。在農(nóng)業(yè)上用銅鹽作微量元素肥料可使農(nóng)作物顯著增產(chǎn),但過量的銅會對動、植物產(chǎn)生毒害作用。至今尚末見硫酸銅對植物根尖細(xì)胞有絲分裂影響的報(bào)告,為此我們進(jìn)行了這方面的研究,以探明硫酸銅對植物根尖細(xì)胞的有絲分裂的影響。1試驗(yàn)劑:硫酸銅的制備蠶豆(ViciafabaL.)產(chǎn)于洞頭,為一年新種。硫酸銅由宜興縣化學(xué)試劑廠出品,為分析純。用蒸餾水將其配制成0.05g/L、0.10g/L、0.25g/L、0.50g/L、1.00g/L5個(gè)不同的濃度。1.2文化問題的檢測選擇飽滿、大小均勻的蠶豆種子于蒸餾水中浸泡1d,讓其吸脹。23℃恒溫培養(yǎng),12h換水1次。待根長至1～2cm時(shí),分別用蒸餾水及0.05g/L、0.10g/L、0.25g/L、0.50g/L、1.00g/L5種濃度的硫酸銅溶液處理4h,恢復(fù)培養(yǎng)24h,用卡諾氏固定液(無水乙醇:冰醋酸=3:1,V/V)固定24h,置70%乙醇于4℃冰箱中保存。取根尖的分生組織,常規(guī)制片,用改良石炭酸品紅染液染色。壓片鏡檢,觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)胞有絲分裂指數(shù)、微核千分率、染色體畸變百分率,并對具有畸變的細(xì)胞進(jìn)行顯微攝影。實(shí)驗(yàn)分組及處理見表1。1.3統(tǒng)計(jì)方法均采用SPSS10.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析。2.1cuso4對各組分裂指數(shù)的影響表2表明,5個(gè)實(shí)驗(yàn)組與組Ⅰ(對照組)比較,其分裂指數(shù)均有顯著差異,即5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的分裂指數(shù)均明顯高于對照組(P<0.01或P<0.001)。分裂指數(shù)隨著CuSO4濃度的增加而升高,組Ⅲ為最大值,隨著CuSO4濃度的進(jìn)一步增加分裂指數(shù)反而有所下降。組Ⅱ與Ⅲ比較、組Ⅲ與Ⅳ比較、組Ⅳ與Ⅴ比較,差異均極為顯著(P<0.001)。2.2cuso4對后期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的影響表3表明,實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,其前期、中期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均高于對照組,其中組Ⅵ的達(dá)顯著水平(P<0.05或P<0.001)。后期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)隨著CuSO4濃度的增加而上升,但隨著CuSO4濃度的進(jìn)一步增加后期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)則明顯下降,組Ⅳ為最大值。其中組Ⅳ、Ⅴ以及Ⅵ與對照組的比較均差異極為顯著(P<0.001)。5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的末期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均低于對照組,其中組Ⅲ、Ⅳ及Ⅵ的均明顯低于對照組的(P<0.01或P<0.001)。2.3cuso4濃度對各組微核率的影響由表4可見,CuSO4能誘發(fā)較高頻率的微核,5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的微核率均明顯高于對照組(P<0.001),其中組Ⅲ的微核率為最大值。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),微核率隨CuSO4濃度的升高而增加,在0.10g/L濃度時(shí)達(dá)最大值,隨著CuSO4濃度的進(jìn)一步增加微核率反而下降。組Ⅱ與Ⅲ比較、組Ⅲ與Ⅳ比較、組Ⅴ與Ⅵ比較,差異均極為顯著(P<0.001)。2.4染色體畸變試驗(yàn)從表5可見,CuSO4有明顯的誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變的作用,5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的染色體畸變率均明顯高于對照組(P<0.001),其中組Ⅳ的染色體畸變率為最大?；兟孰S著CuSO4濃度的升高而增加,在0.25g/L濃度時(shí)達(dá)最大值,隨著濃度的進(jìn)一步增加染色體畸變率反而下降。組Ⅱ與Ⅲ比較、組Ⅲ與Ⅳ比較、組Ⅳ與Ⅴ比較,差異均極為顯著(P<0.001);組Ⅴ與Ⅵ比較差異顯著(P<0.05)。2.5染色體橋的形成硫酸銅處理蠶豆根尖細(xì)胞后,可導(dǎo)致多種類型的染色體畸變。包括間期的單微核、雙微核;前期的微核;中期的微核、斷片、染色體黏連、染色體分散等畸變類型;后期出現(xiàn)滯后染色體、斷片、染色體橋、染色體移動不同步等畸變類型。末期出現(xiàn)染色體橋、染色體滯留、解螺旋不同步等現(xiàn)象。2.5.4后期與正常分裂相比較,后期出現(xiàn)染色體向兩極移動時(shí)的嚴(yán)重不同步性而導(dǎo)致后期出現(xiàn)部分染色體的滯后現(xiàn)象、斷片以及微核的形成等。(1)染色體的滯后現(xiàn)象絕大多數(shù)染色體正常移向兩極,僅個(gè)別染色體或片段滯留于兩極之間(圖1-11)。這反映了個(gè)別染色體移向兩極的速度和進(jìn)程是不同的。(2)染色體移動不同步及微核的出現(xiàn)由于染色體的損傷或由于紡錘絲的破壞而造成后期個(gè)別子染色體移動不同步,并形成微核(圖1-12、13)。(3)染色體橋的形成染色體橋的形成是細(xì)胞分裂異常和染色體畸變的主要特征之一。橋的形成是由于染色體斷裂再融合形成雙著絲粒和無著絲粒的染色體片段的結(jié)果。所以染色體橋的形成往往伴有染色體斷片的出現(xiàn),有單橋、雙橋和多橋(圖1-11、14、15、16)。(4)染色體數(shù)目的加倍由于有絲分裂過程中紡錘絲被破壞,兩組子染色體不能移向兩極而停留在一個(gè)細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致染色體數(shù)目的加倍(圖1-17)。(2)染色體的滯留現(xiàn)象由于個(gè)別染色體受損或活動異常,從而導(dǎo)致了染色體或染色體斷片滯后現(xiàn)象(圖1-19)。(3)染色體的解螺旋不同步有絲分裂的末期實(shí)際上是一子核重建過程,當(dāng)染色體到達(dá)兩極后就開始解螺旋。由于個(gè)別染色體活動異常而出現(xiàn)解螺旋不同步,即大部分染色體已解螺旋形成染色質(zhì)、個(gè)別未解螺旋仍以染色體狀態(tài)存在(圖1-20)。3cuso4對蠶室細(xì)胞微核率、染色體畸變率的影響蠶豆根尖微核及染色體畸變實(shí)驗(yàn)技術(shù)近年來逐漸應(yīng)用于監(jiān)測環(huán)境污染(包括重金屬污染),進(jìn)行遺傳毒理學(xué)研究或篩選誘變劑等工作。蠶豆根尖細(xì)胞染色體大而數(shù)量少,細(xì)胞分生組織增殖周期短,誘變劑進(jìn)入植物體后通過切斷DNA分子或干擾DNA合成與修復(fù),造成染色體損傷,或引起紡錘體絲斷裂及其他畸變而導(dǎo)致微核及各種染色體畸變的形成,其結(jié)果能闡明污染物對生物及人體的危害程度和損傷機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同濃度CuSO4均能使蠶豆根尖分生組織細(xì)胞分裂指數(shù)增加,即5個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度CuSO4的分裂指數(shù)均明顯高于對照組的。CuSO4還能誘發(fā)較高頻率的微核率,5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的微核率均明顯高于對照組;并且微核率隨著CuSO4濃度的增加而升高,在0.10g/L濃度時(shí)微核率的值為最大,隨著CuSO4濃度的進(jìn)一步升高微核率則出現(xiàn)下降。有關(guān)資料表明,微核的形成途徑有兩條:一條途徑是由于前一分裂周期G2期后產(chǎn)生的染色體斷片在分裂過程中不能與正常染色體協(xié)調(diào)活動,在進(jìn)入間期時(shí),即被排斥于核外形成的;另一條途徑是由于各種形式的落后染色體、未及中板集合染色體以及染色體分組造成的。染色體畸變產(chǎn)生可能有幾條途徑:一是由于藥物直接作用于DNA分子,造成DNA斷裂損傷,從而引起染色體畸變;二是由于藥物干擾了DNA、蛋白質(zhì)合成或RNA的轉(zhuǎn)錄,結(jié)果使與染色體運(yùn)動有關(guān)的物質(zhì)不能形成,由此形成染色體畸變;三是藥物還可通過干擾某些損傷的正常修復(fù)過程,阻止染色體在正常情況下的重建,而形成新的重接,出現(xiàn)染色體橋、環(huán)、斷片之類的重排。落后染色體、未及中板集合染色體,均可能是由于硫酸銅破壞了紡錘絲的功能或形成,也可能是干擾了染色體某些自身的運(yùn)動規(guī)律而使染色體不能及時(shí)到達(dá)赤道板,造成落后。染色體數(shù)目的多倍性,也是由于紡錘絲被破壞使得子染色體移向兩極受到障礙,從而造成兩組子染色體滯留在同一細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)表明不同濃度的CuSO4均可導(dǎo)致多種類型的染色體畸變,而且畸變率隨著CuSO4處理濃度的增加而升高,在0.25g/L濃度時(shí)畸變率的值為最大,隨著CuSO4濃度的進(jìn)一步增加則呈現(xiàn)下降。綜上所述,CuSO4對蠶豆根尖細(xì)胞微核率及染色體畸變率的影響總趨勢是一致的,即微核率及染色體畸變率均隨著CuSO4濃度的增加而升高,隨著CuSO4濃度的進(jìn)一步增加而出現(xiàn)下降。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分裂細(xì)胞中有染色體片段、染色體橋的出現(xiàn),說明CuSO4對蠶豆根尖細(xì)胞染色體的主要組成物質(zhì)DNA的結(jié)構(gòu)組成已造成一定影響。CuSO4對蠶豆根尖細(xì)胞遺傳毒性效應(yīng)已得到充分證實(shí),但對蠶豆的其他生物學(xué)效應(yīng)及其分子機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究和探討。1.1材料表面2前期微核試驗(yàn)及畸變2.5.1間期細(xì)胞分裂間期的異常主要出現(xiàn)微核,各組間期微核占間期異常的百分比均為100%。其中有單微核(圖1-1)、雙微核(圖1-2)。2.5.2前期此期的異常表現(xiàn)主要是微核(圖1-3、4),組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ前期微核占前期異常的百分比分別為80.0%、82.5%、81.0%、75.8%、77.0%、78.0%。前期的微核是上次有絲分裂過程中染色體受損或染色體活動異常而形成的