疏肝飲煎劑對肝郁脾虛型腸易激綜合征大鼠的治療作用及對mo、cck的影響

疏肝飲煎劑對肝郁脾虛型腸易激綜合征大鼠的治療作用及對mo、cck的影響

腸易激綜合征（ibs）是一種腸動力學和內(nèi)臟感覺異常的胃腸功能疾病。這是一組臨床表現(xiàn)為排便習慣改變（腹瀉和便秘）、糞便特性異常（稀疏便、粘膜便）、腹脹和腹痛的臨床表現(xiàn)的綜合征，其癥狀可能繼續(xù)存在或延遲。目前認為它是一種生物-心理-社會病證,發(fā)病與內(nèi)臟感覺過敏、腦-腸軸的改變、胃腸動力學的異常和精神行為的異常有關(guān)。目前治療缺乏確切而有效的辦法。中醫(yī)認為腹瀉型IBS發(fā)病和肝郁脾虛、脾胃虛弱有關(guān),疏肝健脾的中藥復方疏肝飲煎劑在臨床上治療本病已取得較好療效。本實驗以血漿和結(jié)腸黏膜中的胃動素(MOT)、膽囊收縮素(CCK)為主要測定指標,以得舒特為陽性對照藥,觀察復方疏肝飲煎劑對腹瀉型IBS模型大鼠的作用。1材料和方法1.1動物和食物Wistar大鼠48只,清潔級,雄性,體重(200±20)g。所有動物在有恒定溫度、濕度及晝夜光線的房間里飼養(yǎng),自由進食、進水。1.2抑肽酶、agtrin肝素鈉注射液、25%烏拉坦(氨基甲酸乙酯)、甲醛溶液、冰醋酸,均為上?；瘜W試劑一廠生產(chǎn)(批號分別為:000830,c20010110,990812,T20020710);抑肽酶(Aprotinin),美國Amresco(批號:3212B60);得舒特(匹維溴安),法國蘇威制藥(批號:0020)。膽囊收縮素試劑盒由第二軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室提供,胃動素試劑盒由中國人民解放軍海軍放免技術(shù)中心提供。疏肝飲煎劑:由防風、白芍藥、白術(shù)、陳皮、柴胡等藥物組成,按一定比例制成生藥濃度分別為1.50、0.75、0.45g/ml,備用;番瀉葉在沸水中浸泡15min后雙層紗布過濾,濾液減壓濃縮成生藥含量為0.6g/ml,備用。1.3實驗方法1.3.1灌胃量ld50大鼠隨機分組為正常組、模型組、西藥組,以及大、中、小劑量中藥組,每組8只。正常組:正常喂食,自由飲水,不予任何處理;模型組:以蒸餾水灌胃(10ml/kg);西藥組:以1.5mg/ml的得舒特灌胃(15mg/kg);大劑中藥組:以1.50g/ml的疏肝飲煎劑灌胃(15g/kg);中劑中藥組:以0.75g/ml的疏肝飲煎劑灌胃(7.5g/kg);小劑中藥組:以0.45g/ml的疏肝飲煎劑灌胃(4.5g/kg)。1.3.2棉繩束縛大鼠的或排糞IBS動物模型為脾虛加局部束縛刺激。所有動物單只單籠飼養(yǎng)1周,開始實驗。正常組不以任何處理,其余各組動物以番瀉葉水煎劑(濃度為0.6g/ml,按15ml/Kg)灌胃,每日1次,持續(xù)兩周。從第二周起,給以束縛刺激。用粗制棉繩束縛大鼠的雙后肢,影響其正常行動,但不完全限制自由,被束大鼠可以拖后肢緩慢爬行。束縛持續(xù)1周,每天5h。束縛的最后兩天,束縛后將大張濾紙墊于籠下,計算5h內(nèi)的排便數(shù)以及糞便污染濾紙的直徑。藥物干預各組在第二周開始用藥,持續(xù)1周,束縛刺激在給藥后進行。1.4指標和方法的檢測檢測大鼠糞便的稀便級,血漿中MOT、CCK的含量,結(jié)腸黏膜中MOT、CCK的含量,降結(jié)腸組織形態(tài)學檢測。1.4.1本例第4段1.4.2動脈血與抑肽酶時間的測定大鼠以25%烏拉坦(0.5ml/100g體重)腹腔注射麻醉后,從腹主動脈中采集動脈血5ml,加入預冷的、加有1%肝素100μl(每毫升動脈血20μl)和抑肽酶2500U(每毫升動脈血500U)的塑料試管中,充分混勻后,立即在4℃以3000r/min離心15min。抽取上清液-70℃低溫保存待測。1.4.3移動法提取距肛門5cm處向上剪取降結(jié)腸一段,長約5cm,沿腸系膜剪開,4℃0.9%NaCl溶液中漂洗干凈,再置于沸騰的0.9%NaCl溶液中煮5min。刮取適量腸黏膜,稱重后將黏膜置于勻漿器內(nèi),并加入冰醋酸1ml充分勻漿,后轉(zhuǎn)入試管中,室溫下(25℃)靜置2h后加入氫氧化鈉1ml,中和醋酸。在4℃以3000r/min離心15min。抽取上清液-70℃低溫保存待測。1.4.4大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學檢測每組隨機選取2只大鼠,取其降結(jié)腸10%甲醛溶液固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學的變化。1.5比較owolsyndr機構(gòu)間差異的顯著性實驗結(jié)果以表示。用t檢驗IrritableBowelSyndrome比較兩組數(shù)據(jù)間差異的顯著性,one-wayANOVA檢驗比較多組數(shù)據(jù)間差異的顯著性,P<0.05表示具有顯著性差異。2結(jié)果2.1藥物治療后血漿中mot、cck表達變化實驗過程中,共死亡4只大鼠,分別為西藥組2只、中劑量中藥組1只、小劑量中藥組1只,其余存活狀況良好。結(jié)果表明,番瀉葉灌服聯(lián)合束縛刺激可明顯增加大鼠的稀便級,與正常組相比有顯著性差異(P<0.01),表明該法可以制成大鼠腹瀉模型。經(jīng)得舒特治療后,稀便級有明顯下降,與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)。大劑量和中劑量疏肝飲藥物治療后稀便級得到改善(P<0.05),小劑量的治療效果不明顯。大劑量和中劑量的疏肝飲煎劑對稀便級的影響與西藥組相似(P>0.05)(表2)。2.2各組大鼠血漿中MOT、CCK含量的變化經(jīng)過束縛-制動刺激聯(lián)合番瀉葉灌胃后,大鼠動脈血血漿中MOT的含量幾乎沒有變化,與正常組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);藥物治療后各組對MOT含量變化的影響亦很小,正常、模型和各用藥組間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。造模后大鼠血漿中CCK的含量大幅度降低,與正常組相比有顯著性差異(P<0.05);經(jīng)藥物治療一段時間后CCK含量較模型組明顯降低(P<0.05),疏肝飲煎劑各劑量間CCK含量的變化沒有顯著性差異,CCK含量降低的程度與疏肝飲用藥劑量間不存在明顯的依賴關(guān)系(表3)。2.3藥物治療對mot含量不高干預的療效判定經(jīng)過束縛-制動刺激聯(lián)合番瀉葉灌胃后,大鼠結(jié)腸黏膜中MOT的含量亦幾乎沒有變化,藥物治療對MOT含量無明顯干預作用。而結(jié)腸黏膜中CCK模型組的含量較正常組明顯升高(P<0.05);經(jīng)得舒特和疏肝飲治療后CCK在黏膜中的含量下降,與正常組比較無顯著性差異(P>0.05),說明藥物有明顯的療效(表4)。2.4間質(zhì)及病理變化正常組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完好,上皮無剝脫,固有腺體無異常,間質(zhì)無充血、水腫、炎細胞浸潤等;模型組與正常組比較,除個別動物間質(zhì)輕微充血、炎細胞浸潤略明顯外,其余無特殊病理變化;各用藥組腸黏膜結(jié)構(gòu)基本完好,未見明顯充血水腫。3苦微寒—討論臨床上IBS的發(fā)生和心理精神的異常關(guān)系密切,異常精神生活可能通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動的改變導致胃腸道等由自主神經(jīng)控制的器官的功能紊亂,出現(xiàn)焦慮、強迫、抑郁等各種臨床癥狀。在中醫(yī)學理論中肝脾關(guān)系密切,肝的疏泄功能對脾胃的升清降濁之間的平衡有重要意義。一旦肝木有病,則“肝病必犯土,是侮其所勝也。克脾則腹脹,便或溏或不爽……木郁不達,風木沖擊而賊脾土,則痛于臍下”(《臨證指南醫(yī)案》)?！夺t(yī)方考》認為:“瀉責之于脾,痛責之于肝,肝責之于實,脾責之于虛,脾虛肝實,故令痛瀉?！备篂a型IBS最主要的癥狀是瀉前腹痛、瀉后痛減,基本病機在于肝郁脾虛。由此我們采用以番瀉葉灌胃建立大鼠脾虛模型,結(jié)合束縛刺激而成的IBS動物模型以泄瀉為主要癥狀,且伴有煩躁、抑郁、焦慮等變化,與腹泄型IBS臨床癥狀相似。本實驗使用的疏肝飲煎劑是以疏肝健脾為法,在古代名方痛瀉要方的基礎(chǔ)上加一味柴胡按一定比例組成。歷代醫(yī)家均以痛瀉要方治療腸鳴腹痛、瀉后痛減的痛瀉之癥。中醫(yī)臨床上治療肝郁脾虛型IBS多選本方。其中白術(shù)有“濕去而瀉止,瀉止而脾健,脾健而胃亦健”之功。白芍藥酸苦微寒,平肝柔肝緩急止痛,“其功全在平肝,肝平則不克脾胃,而臟腑各安……瀉痢自去,痢痛自安矣”。防風辛溫,散肝醒脾,且有勝濕之功。陳皮辛溫,理氣健脾燥濕,尚能行氣止痛。在上述藥物的基礎(chǔ)上,加入苦微寒之柴胡一味,功在疏肝解郁和中。胃腸運動主要受腸神經(jīng)系統(tǒng)的支配及體液因素的影響。胃腸激素是調(diào)節(jié)胃腸運動的重要激素,它通過干擾胃腸道的動力與分泌吸收功能,以及對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用而對IBS產(chǎn)生一定的影響。目前認為與IBS關(guān)系較為密切的胃腸激素有MOT、CCK、血管活性腸肽(VIP)、生長抑素(SS)、P物質(zhì)(SP)、五羥色胺(5-HT)等。產(chǎn)生MOT的細胞成為M0細胞,主要存在于十二指腸和近端空腸黏膜隱窩,以及消化道組織的黏膜下層和肌層的神經(jīng)組織中。它的生理功能是調(diào)節(jié)胃腸、膽囊、食管的運動,促進胃腸運動和胃腸道對水、電解質(zhì)的運輸,主要通過直接作用于消化道平滑肌細胞上的受體,導致細胞內(nèi)Ca2+濃度增高進而引起強烈的刺激上消化道的機械運動和電活動的作用而實現(xiàn)。MOT和IBS的關(guān)系各家說法不一,這可能與胃動素分泌影響因素的眾多以及空腹時血中含量呈周期性變化有關(guān)。實驗結(jié)果表明,血漿中MOT的含量在正常大鼠和應激大鼠之間并無明顯異常,但在降結(jié)腸黏膜組織中,正常組和各用藥組都可以測到MOT的存在,但各組間沒有顯著性差異。本實驗的各組動物中血漿和結(jié)腸黏膜中MOT的變化沒有很好的規(guī)律性,可能是與MOT的周期性變化和影響因素眾多有關(guān)。CCK以多種激素形式存在于血漿和胃腸組織中,它的主要作用是促使膽囊和胃腸平滑肌興奮收縮。國內(nèi)學者對CCK的具體作用機制研究不多,國外有報道稱IBS患者空腹時血漿中CCK水平明顯高于正常人,而局部結(jié)腸組織中含量幾乎為零。我們的實驗結(jié)果表明,模型組CCK在血漿中含量較正常組為低(P<0.05)。同時結(jié)腸黏膜組織中各組CCK含量均不為零,模型組反而較正常組為高,兩者之間有顯著性差異。血漿中和腸道黏膜組織中CCK的含量變化的不一致性,可能是由于兩者產(chǎn)生來源的不同所致。腸道黏膜中含有CCK的釋放細胞,對于應激等外來刺激可以直接產(chǎn)生反饋,使大鼠腸道敏感性增加,CCK分泌增多,這種反饋性增多主要在局部組織起作用,所以血漿中含量的影響相對較小。得舒特作用是否與調(diào)整胃腸激素的水平有關(guān)尚無完整報道,本實驗中得舒特可以改善IBS患者某些激素水平升高的情況,尤其是結(jié)腸黏膜中的CCK的含量。疏肝飲可以降低結(jié)腸黏膜中CCK的含量,但大中小各劑量之間,沒有呈現(xiàn)出很好的量