黃柏中粗黃酮提取工藝研究

黃柏中粗黃酮提取工藝研究

西蘭花也被稱為金針菜。有一天，百合會微笑著死去。它通常被稱為金針蔬菜，屬于百合科玄草科。明代李時珍在《本草綱目》中謂其有安神醒腦、增智寬胸、美顏養(yǎng)血、解熱消毒、除煩通乳之功效。其主要化學成分有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物,還有多種維生素、生物堿、苷、黃酮類、胡蘿卜素、揮發(fā)油、鞣質(zhì)以及無機礦物鈣、磷等。據(jù)《中藥大辭典》記載,黃花菜含有生物堿0.7%,苷1.8%,黃酮類0.75%,β-胡蘿卜素0.36%。黃花菜總黃酮是其重要有效成分之一,它具有增強免疫力、活血化瘀、保肝抗炎、抗菌抗病毒、抑制腫瘤、延緩衰老、抗氧化自由基活性作用等多種保健功能。因此近年來黃酮類化合物成為新藥開發(fā)研究中的一個非常重要的資源,具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景,本實驗采用單因素試驗和正交試驗對回流法提取黃花菜粗黃酮的最佳條件進行研究,采用單因素試驗對超聲法提取黃花菜總黃酮的最佳條件進行研究,以蘆丁為標準品繪制標準曲線測定總黃酮含量為指標,探尋黃花菜總黃酮制備工藝,為進一步開發(fā)可利用資源提供理論依據(jù)。1材料表面1.1材料預(yù)處理稱取過60目篩黃花菜干燥粉末樣品5.00g置于索氏提取器中,加120mL乙醚回流4h,脫至無色,自然風干備用。1.2樣品的制備精確稱取干燥至恒重的蘆丁標準品0.1520g,置于250mL容量瓶中,用30%乙醇溶解并定容至250mL,搖勻即得濃度為0.608mg/mL標準品溶液。量取上述溶液0.0mL,1.2mL分別于25mL容量瓶,加30%的乙醇約至12.5mL,加5%的亞硝酸鈉溶液0.8mL,放置5min,加5%的硝酸鋁溶液0.8mL,搖勻,放置6min,后加4%的氫氧化鈉溶液5mL,30%的乙醇定容至刻度,混勻,放置15min。以加蘆丁標準品溶液0.0mL的處理液為參比液,對加蘆丁標準品1.2mL的處理液在400~800nm范圍內(nèi)掃描,得到其吸收光譜,測得最大吸收波長為510nm。以相同方法將蘆丁標準品溶液換為提取液處理后,測得吸收光譜最大吸收波長同樣為510nm。據(jù)上可知可用蘆丁作為黃花菜的黃酮測定用標準品,顯色反應(yīng)后,在最大吸收波長510nm處測吸光度。1.3標準曲線方程準確移取上述蘆丁標準品溶液0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mL于25mL容量瓶中,以上述方法顯色反應(yīng)后,在510nm處測得吸光度。以吸光度(Abs)為縱坐標,質(zhì)量濃度(C)為橫坐標作圖。標準曲線方程為A=0.00787C-0.00911,R2=0.9993。根據(jù)A與濃度C的關(guān)系可繪制出線性很好的標準曲線。說明黃酮的質(zhì)量濃度在0~58.3680mg/L范圍內(nèi),A與質(zhì)量濃度C之間呈良好的線性關(guān)系,可按標準曲線法進行定量分析。1.4硝酸鹽總總反應(yīng)物吸光度的測定準確稱取1.0mL提取液于50mL容量瓶中,加30%的乙醇約至25mL,加5%的亞硝酸鈉溶液0.8mL,放置5min,加5%的硝酸鋁溶液0.8mL,搖勻,放置6min,后加4%的氫氧化鈉溶液5mL,30%的乙醇定容至刻度,混勻,放置15min,用紫外分光光度計在510nm處測其吸光度。2方法2.1返回提取法2.1.1單因素實驗2.1.1.固液比的篩選分別準確稱取黃花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,當溫度調(diào)至95℃時,分別以1︰8、1︰10、1︰12、1︰14、1︰16的固液比加75%乙醇回流提取2h,以確定最佳提取固液比。按標準曲線方法用紫外分光光度計在510nm處測其吸光度。由圖2可知,固液比為1︰12時樣品含量測定結(jié)果所得吸光度很大,且與最大值相差不大,因此,可確定回流提取的最佳固液比為1︰12。2.1.1.提取溫度的確定分別準確稱取黃花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,溫度分別調(diào)至80、85、90、95、100℃時,以1︰12的固液比加入75%乙醇回流提取2h,以確定最佳提取溫度。按標準曲線方法用紫外分光光度計在510nm處測其吸光度。由圖3可知,提取溫度T=95℃時,樣品含量測定結(jié)果所得吸光度有最大值,因此可確定提取溫度因素的最佳實驗條件為T=95℃,因為其兩側(cè)水平所得樣品吸光度高于其他,因此確定正交試驗的提取溫度因素的三個水平為:T=90℃,T=95℃,T=100℃。2.1.1.提取醇濃度的確定分別準確稱取黃花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,在95℃下,1︰12的固液比加入75%、80%、85%、90%、95%乙醇回流提取2h,以確定最佳提取醇濃度。由圖4可知,當醇濃度=95%時,樣品含量測定結(jié)果所得吸光度有最大值,因此可確定醇濃度因素的最佳實驗條件為95%,因為其兩側(cè)水平與其相差不大,因此確定正交試驗的醇濃度因素的3個水平為:85%,90%,95%。2.1.1.最佳提取時間的測定分別準確稱取黃花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,95℃,1︰12的固液比加入85%乙醇分別回流提取1、1.5、2、2.5、3h,以確定最佳提取時間。按標準曲線方法用紫外分光光度計在510nm處測其吸光度。由圖5可知,提取時間t=2.5h時,樣品含量測定結(jié)果所得吸光度有最大值,因此可確定提取溫度因素的最佳實驗條件為t=2.5h,因為t=3h所得樣品吸光度開始降低,說明時間延長并不能提高黃酮提取效率的率,因此,從省時高效角度確定正交試驗的提取溫度因素的3個水平為:t=1.5h,t=2h,t=2.5h。2.1.2正交實驗2.1.2.1.正交試驗設(shè)計表12.1.2.提取、溶解方法準確稱取黃花菜粉末5.00g,將其包成藥包置于索氏提取器中,按上述正交表逐一進行提取,濃縮,溶解,含量測定。見表2~3。比較各因素的極差可知因素A對試驗結(jié)果影響最大,其次是B→C,所以各因素對黃酮提取效率影響大小順序為A→B→C,通過正交試驗得出的最佳提取工藝為A3B3C2,即醇濃度為95%,在95℃下提取2.5h。2.2超聲提取法2.2.1固液比的確定分別準確稱取黃花菜粉末5.00g,分別以1︰8、1︰10、1︰12、1︰14、1︰16的固液比向錐形瓶中加入75%乙醇,后將錐形瓶放入超聲清洗器中,用鐵架臺固定住并超聲提取40min,以確定最佳提取固液比。按標準曲線方法用紫外分光光度計在510nm處測其吸光度。2.2.2超聲提取時間的確定分別準確稱取黃花菜粉末5.00g,分別以1︰12的固液比向錐形瓶中加入75%乙醇,后將錐形瓶放入超聲清洗器中,用鐵架臺固定住并分別超聲提取20、30、40、50、60min,以確定最佳提取提時間。按標準曲線方法用紫外分光光度計在510nm處測其吸光度。2.2.3最佳提取醇濃度的確定分別準確稱取黃花菜粉末5.00g,將藥材放入錐形瓶中,當超聲清洗器的水溫調(diào)至55℃時,以1︰12的固液比向錐形瓶中分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇,后將錐形瓶放入超聲清洗器中,用鐵架臺固定住并分別超聲提取40min,以確定最佳提取醇濃度。按標準曲線方法用紫外分光光度計在510nm處測其吸光度。由上述圖表分析可知,固液比為1︰16時樣品含量測定結(jié)果所得吸光度有最大值,但與1︰12時相差不大,從成本考慮,應(yīng)選用1︰12的固液比為宜。當t=40min時樣品含量測定的吸光度有最大值,當時間過長或過短都能使提取效率降低。當醇濃度為90%時吸光度最大,但當醇濃度為80%時吸光度與90%時吸光度相接近,為了節(jié)約成本,在應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)時,應(yīng)選用80%濃度的乙醇。3工藝優(yōu)化3.1水浴鍋提取液的制備分別準確稱取黃花菜粉末5.00g,將其包成藥包置于索氏提取器中,當水浴鍋的溫度調(diào)至95℃時,以1︰12的固液比向150mL的平底燒瓶中加入95%乙醇回流提取2.5h,平行3次。按標準曲線方法用紫外分光光度計在510nm處測其吸光度。3.2超聲提取法分別準確稱取黃花菜粉末5.00g,將藥材放入錐形瓶中,當超聲清洗器的水溫調(diào)至55℃時,以1︰12的固液比向錐形瓶中分別加入90%乙醇,后將錐形瓶放入超聲清洗器中,用鐵架臺固定住并分別超聲提取40min,平行3次。按標準曲線方法用紫外分光光度計在510nm處測其吸光度。3.3最佳提取工藝的確定提取效率與吸光度成正比,所以回流法提取效率高于超聲法的提取效率。所以黃花菜中粗黃酮提取的最佳工藝優(yōu)化為:以醇為溶劑且濃度為95%,在95℃下回流提取2.5h。由于不同地區(qū)的黃花菜生活環(huán)境不同,其所蘊藏的黃酮含量有所差別,