干熱河谷區(qū)花生根瘤菌耐旱性鑒定

干熱河谷區(qū)花生根瘤菌耐旱性鑒定

花生是重要的科豆科植物，可以與土壤中的根瘤菌一起形成腫瘤中的固氮。據(jù)估計，花葉草所需的1.3.2.3來自共生固體氮的作用。因此，在花的種植區(qū)，尤其是在新的種植區(qū)，對花的根瘤菌的培養(yǎng)是主要的收獲措施。然而，在實際生產(chǎn)中，干燥和堿是土壤中根瘤菌常見的不利環(huán)境條件。據(jù)報道，許多重要豆科植物產(chǎn)生的根瘤菌，如大豆根瘤菌、大豆根瘤菌和三葉草根瘤菌，對高滲環(huán)境敏感，但在惡劣條件下分布的根瘤菌菌株具有良好的適應(yīng)性。陳文新、關(guān)桂蘭等對新疆干旱地區(qū)根瘤菌資源的研究表明，該地區(qū)根瘤菌的生長和對寄主植物的感染以及氮和鎂的作用均不同于其他生態(tài)區(qū)。顯著特點是，在高溫、干旱和堿性條件下，它可以生長和分解，污染主要植物，并將腫瘤固氮，從而顯示良好的環(huán)境適應(yīng)性。金沙江干熱河谷區(qū)由于受地理位置、山川走向及氣候上的焚風效應(yīng)與山谷風的局部環(huán)流作用等多種自然因素的綜合影響,形成了特殊的干熱氣候.表現(xiàn)為高溫少雨,空氣干燥,全年有半年以上的旱期(月干燥度>2.0),局部河段全年呈現(xiàn)半干旱或干旱狀態(tài).在該區(qū)分布有較大面積的花生種植區(qū),且種植歷史長,花生品種多,種植土壤類型多樣,土壤中存在大量的土著花生根瘤菌.因此,我們對這種特殊環(huán)境下土著花生根瘤菌的耐旱性進行了研究,并試圖從中篩選出高效耐旱菌株,為花生生產(chǎn)服務(wù).1材料和方法1.1花生根瘤菌株的分離與純化從金沙江干熱河谷區(qū)的攀枝花市、西昌、元謀、華坪等地的花生產(chǎn)區(qū)分離的45株花生根瘤菌列于表1.在所有采樣區(qū)均未進行過花生根瘤菌的人工接種.菌株經(jīng)分離純化后,用液體培養(yǎng)法進行了回接試驗.1.2抗旱性分析1.2.1培養(yǎng)條件的確定使用聚乙二醇6000(PolyethyleneGlycol6000)人工摸擬干旱條件,在YMB培養(yǎng)基中加入不同量的PEG6000,使培養(yǎng)液的滲透勢Ψ分別為0mPa、-0.2mPa、-0.4mPa、-0.5mPa、-0.6mPa、-0.7mPa、-0.8mPa、-1.0mPa共8個水平,每水平設(shè)3次重復(fù).各水平所加PEG6000的量按文獻進行.1.2.2生長繁殖測定將供試菌株分別挑取1～2環(huán)接種于已滅菌的YMB培養(yǎng)液中(40mL/150mL瓶),置于28℃條件下振蕩(n=160r/min)培養(yǎng)5d(14h/d)后,再用1mL無菌吸管吸取菌懸液1mL在無菌條件下接種于各處理中,每次吸取菌液時,將接種液振蕩均勻.將供試菌株振蕩培養(yǎng)7d后,取出后振蕩均勻,然后取樣,并對濁度大的菌懸液作適當稀釋,用7230型分光光度計和1cm比色杯在420nm下比濁,測定其D420nm,以D420nm的大小表示其在各干旱水平下的生長繁殖狀況,在測定前用相應(yīng)濃度PEG6000的YMB營養(yǎng)液對儀器進行調(diào)零.1.3培養(yǎng)基成分分離純化和保存菌種的培養(yǎng)基為YMA,測定耐旱性的培養(yǎng)基是YM培養(yǎng)液,pH值調(diào)至7.0～7.2.YMA培養(yǎng)基成分如下:甘油5mL,甘露醇5g,NaCl0.1g,MgSO4·7H2O0.28g,K2HPO40.5g,酵母粉1.5g,瓊脂18g,加蒸餾水至1000mL,1%剛果紅4mL.2結(jié)果和討論2.1生長聚類分析如以菌株在某滲透勢下能否增殖為劃分根瘤菌耐旱標準,用平均連鎖法對供試的45個花生根瘤菌菌株耐旱能力相似性進行聚類分析,聚類結(jié)果表明:供試菌株的耐旱能力可分為五類群(見圖1).再對供試的45株漫生型花生根瘤菌菌株在各滲透勢水平下測得濁度的相對值(即各菌株在各水平下的D420nm值與相應(yīng)0mPa的D420nm值的比值)進行方差分析(見表2).以上的聚類和方差分析表明:金沙江干熱河谷區(qū)土著花生根瘤菌耐旱能力呈現(xiàn)多樣性,來自同一土壤的土著花生根瘤菌之間的耐旱能力也呈多要性分析,這種多樣性分布可能由于當?shù)胤N植制度、土地利用狀況、土壤類型等方面差異,加之土壤是一個不連續(xù)的高度異質(zhì)體,這種高度異質(zhì)環(huán)境使根瘤菌在土壤中所處的微環(huán)境存在差異,這些差異使土著花生根瘤菌向不同方向進化,從而表現(xiàn)出耐旱能力多樣性特點;同時方差分析還顯示干旱對土著花生根瘤菌生長存活的影響相當顯著(P<0.0001).2.2種生長模式下的穩(wěn)定性比較供試菌株在模擬干旱條件下的生長模式的影響也不盡相同,在該實驗條件下,供試菌株主要表現(xiàn)為3種模式:第一種模式在Ψ=-0.2mPa時,菌株Spr16-5、Spr16-7、Spr17-1、Spr19-3、Spr22-1、Spr25-4、Spr26-4、Spr26-5、Spr29-5的生長不但沒有被抑制,其濁度值反而略高于CK(Ψ=0mPa)(見圖2),然后又隨著水的下降而降低,說明-0.2mPa滲透勢刺激了這些花生根瘤菌的生長,這與楊蘇聲等對快生大豆根瘤菌RT19的耐鹽性研究的報道相似.第二種模式菌株Spr27-1、Spr29-6一方面存在一個中間致死滲透勢,即菌株在某滲透勢時存活數(shù)量減少或增殖能力減弱,而在另一更低水勢時存活數(shù)量又增高.此現(xiàn)象與Fuhramann和Vicent的報道相一致.Rensburg認為這是由于中間相對濕度使細胞部分失水,從而對其功能酶造成損傷,而在更低水勢情況下,存活率提高是由于酶的正常功能受到保護所致(見圖3).第三類生長模式隨著滲透勢的下降,培養(yǎng)液的濁度值也隨之下降(見圖4).這些菌株是Spr16-1、Spr16-2、Spr16-6、Spr16-8、Spr18-1、Spr18-3、Spr18-4、Spr18-5、Spr20-2、Spr22-3、Spr22-4、Spr22-5、Spr22-6、Spr23-1、Spr23-2、Spr23-3、Spr23-4、Spr23-5、Spr23-6、Spr24-3、Spr24-4、Spr24-5、Spr25-1、Spr25-2、Spr26-1、Spr26-2、Spr27-2、Spr27-3、Spr28-1、Spr29-1、Spr29-2、Spr29-4、Spr29-7共33個菌株,占供試菌株的73.3%.由此可見,干熱河谷區(qū)土著花生根瘤菌在干旱條件下的生長模式呈現(xiàn)多樣性.3spr29-5等菌株在+2.2mpa滲透勢下的生長3.1本實驗結(jié)果表明,金沙江干勢河谷花生種植區(qū)以及同一土壤類型中大量存在的土著花生根瘤菌耐旱能力表現(xiàn)為多樣性特點;3.2干勢河谷區(qū)土著花生根瘤菌在干旱條件下的生長模式呈現(xiàn)多樣性特征,主要表現(xiàn)為三種生長模式:Spr29-5等菌株在-0.2mPa滲透勢條件下的生長好于對照(即不加PEG6000處理);Spr27-1等菌株存在一個中間致死滲透勢;Spr25-2等菌株的生長狀況隨著介質(zhì)滲透勢的降低而降低;3.3在所有的供試菌株中篩選出兩個最耐旱菌株Spr25-2、Spr29-5,它們在-1.0mPa(即-10