淡紫擬青霉的生長和產(chǎn)孢條件研究

淡紫擬青霉的生長和產(chǎn)孢條件研究

敏感性半知菌亞門、絲菌素、絲菌素、叢慶學和假青霉的主要特征是，細胞的莖以傘狀或幾乎球形（瓶狀）為特征，在絲端或短枝的誘導下，以單帶狀體生。到目前為止，該物種已有50種，均為昆蟲和線蟲病原體。1淺紫色和綠色霉的生物學特征1.1分生孢子損害淡紫擬青霉在28℃、黑暗條件下,PDA平板培養(yǎng)3d后長出白色菌落,產(chǎn)孢后逐漸變成淺粉紅色,培養(yǎng)7d后,菌落呈紫紅色、圓形、隆起、粉狀,表面沒有分泌物,產(chǎn)孢量越多,菌落顏色越深。淡紫擬青霉的分生孢子梗末端膨大。分生孢子為單細胞,橢圓形至紡錘形,呈鏈狀、平滑、無色至黃色,2m~4m寬,孢梗上具有瓶頸狀不規(guī)則的分枝或輪生分枝,瓶?；枯^寬。輪生分枝由圓柱形的部分組成,有時分枝向遠離主軸方向彎曲。1.2培訓性能1.2.1生長和產(chǎn)孢條件研究溫度、光照是影響其生長的最主要因素。CabanillasE(1989a)、王明祖(1992)、劉杏忠(1995)、李芳(2007)研究了淡紫擬青霉的生長和產(chǎn)孢條件,結果表明:生長溫度范圍可以從8℃~38℃,生長和產(chǎn)孢的最適溫度范圍是25℃~30℃,10℃和40℃時停止生長,35℃時停止產(chǎn)孢。全黑暗條件有利生長和產(chǎn)孢,半光照次之,全光照最差。周靖(2007)研究結果表明:以蔗糖為碳源(60g/L),硝酸銨為氮源(1.5g/L)。pH5~pH6,培養(yǎng)溫度為30℃時最適合該菌的生長。1.2.2淡水紫紫擬青霉的制備和培養(yǎng)淡紫擬青霉對營養(yǎng)條件要求不高,不僅能在多種常規(guī)培養(yǎng)基上生長,而且能在多種自然基質(zhì),如農(nóng)副產(chǎn)品廢料、廢渣與植物葉片或植物浸提液中生長。王明祖(1992)等研究表明認為馬鈴薯、蛋白胨、蔗糖、硝酸鈣、磷酸氫二鈉組成的培養(yǎng)基和豬糞浸出液瓊脂培養(yǎng)基有利于該菌的營養(yǎng)生長。潘滄桑(1997a、1997b)、鄧國平(2007)等利用糖廠、啤酒廠、木薯加工廢液進行淡紫擬青霉菌劑的生產(chǎn)研究,既可使廢料資源化,又可減少環(huán)境污染。盡管淡紫擬青霉能在多種培養(yǎng)基質(zhì)上和多種生態(tài)條件下生長,但不同成份的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件,其產(chǎn)菌率與代謝物也有所不同。李芳(2004、2005、2006)研究了不同通氣量、不同培養(yǎng)基、不同基質(zhì)濃度對淡紫擬青霉NH-PL-03菌株生長的影響,結果表明,碳氮源濃度為0.045g/ml,每瓶(250ml)裝液量為50ml時最適合淡紫擬青霉NH-PL-03菌株菌絲和孢子生長,而對線蟲的毒力的最佳裝液量為100ml;在孟加拉紅、PDA和察氏培養(yǎng)基上,菌絲量增長最為顯著,在察氏和燕麥培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大,培養(yǎng)液濾液的毒力隨培養(yǎng)時間延長而升高,在察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)毒力較高。梁照文(2008)研究了不同液體培養(yǎng)基對淡紫擬青霉繁殖和毒力的影響,篩選了一種高產(chǎn)孢量的培養(yǎng)基,主要成分為200g/L馬鈴薯、1%雞蛋黃、20g/L蔗糖。CayrolJC(1989)研究表明:利用麥芽培養(yǎng)基在靜止、透氣狀態(tài)下生產(chǎn)的菌液,殺線蟲活性最強,光照對菌液的毒性沒有影響。2濃度對淡水紫紫擬青霉的影響一種生防菌在作物根圍或根內(nèi)定殖能力與防治效果有密切關系。生防菌同土著微生物競爭營養(yǎng)、空間的能力強弱是其在土壤中存活、定殖的關鍵;在作物的根際或根內(nèi)存活的時間越長,生防效力越持久。在淡紫擬青霉定殖研究中,孫漫紅等(1998)研究了淡紫擬青霉在溫室無菌土栽培大豆中的定殖情況,試驗表明該菌可以在大豆根際定殖,根內(nèi)也檢測出少量淡紫擬青霉的存在,但4周后,根際菌量有所下降。祝明亮等(2004a)研究表明,淡紫擬青霉可以在烤煙根際、根表定殖;根內(nèi)則是不同烤煙,定殖情況不同,定殖量少甚至不能定殖。劉國坤(2009)等用蝦殼粉與淡紫擬青霉混合施用,能使淡紫擬青霉在土壤中周年保持較高的存活量。成儒萍(2010)將淡紫擬青霉PL221以孢子和固體發(fā)酵物的形式施入土壤,都可在土壤中存活至少60d,其中以固體發(fā)酵物形式施入土壤中的存活量較高。CabanillasE(1988)和BhatMY(2009)用試驗證明了淡紫擬青霉可以在番茄和苦瓜的根內(nèi)定殖;RumbosCI(2006)研究表明淡紫擬青霉可以在多種作物中定殖,并首次在健康的大麥根組織中分離到大量的淡紫擬青霉。但HollandRJ(2003)研究了淡紫擬青霉在8種作物中的定殖情況,結果在多種作物根內(nèi)沒檢測到任何的淡紫擬青霉,只在根表檢測到淡紫擬青霉,但與寄生在根結線蟲表面的淡紫擬青霉形態(tài)相比,兩者截然不同,表明了淡紫擬青霉不能在植物根內(nèi)定殖。淡紫擬青霉除了能防治線蟲外,還能促進植物的生長。淡紫擬青霉發(fā)酵液具有類似生長素和細胞分裂素的作用,可以促進小麥芽鞘和黃瓜子葉的生長(劉杏忠,1991)。一定濃度的淡紫擬青霉培養(yǎng)液能促進番茄幼苗生長,大豆、小麥、水稻種子對該濾液敏感度有差異,高濃度濾液相對表現(xiàn)出抑制萌發(fā)和生長的作用。(林茂松,1999)。3淺紫色對植物線蟲的寄生蟲作用和寄生蟲機制3.1不同菌株對南方根結線蟲的寄生蟲能力淡紫擬青霉可以寄生多種植物線蟲,包括根結線蟲、孢囊線蟲等重要經(jīng)濟線蟲的卵和幼蟲,在其代謝過程中,可以產(chǎn)生具有殺線蟲活性的物質(zhì),抑制線蟲的孵化或直接使卵失去活性。弄清楚淡紫擬青霉如何寄生線蟲,對于正確使用該生防菌,提高防效有很大幫助。多年來,國內(nèi)外學者做了大量研究。高學彪(1998)和汪軍(2009)分別采用雙溫測定法,室內(nèi)測定淡紫擬青霉對南方根結線蟲和香蕉根結線蟲卵的相對寄生率為92.6%和94.3%。汪來發(fā)(2004)研究了來自不同地域的淡紫擬青霉的13個菌株,分別用其孢子液處理南方根結線蟲卵囊、孢子液處理分散卵粒、菌絲處理分散卵粒,結果表明了不同菌株對南方根結線蟲的寄生能力有很大差異,且用孢子液處理卵囊的寄生率顯著高于其他兩種處理,寄生能力最強的菌株其寄生率可達74.62%。張雯等(2004)研究了淡紫擬青霉對根結線蟲的侵染作用,結果發(fā)現(xiàn),菌絲侵入線蟲卵消化了卵內(nèi)容物而卵殼完整,推測幾丁質(zhì)酶在侵染卵過程中起穿透卵殼幾丁質(zhì)層的作用,而不以幾丁質(zhì)為營養(yǎng)。劉國坤(2006)對淡紫擬青霉FZ-0289菌株體外寄生南方根結線蟲卵進行了研究,結果表明接種7d后,對胚胎發(fā)育期卵的寄生率為98.2%,對含卵的寄生率為88.6%,卵囊接種14d后,卵囊內(nèi)卵寄生率為94.5%。淡紫擬青霉PL050705菌株離體寄生柑橘半穿刺線蟲,對胚胎期卵的寄生率為83.33%,對卵內(nèi)有幼蟲卵的寄生率為43.75%(肖順,2008a)。HollandRJ(1999)等研究了淡紫擬青霉體外寄生爪哇根結線蟲卵、3齡、4齡幼蟲和雌蟲成蟲,結果表明:淡紫擬青霉侵染卵過程中,菌絲首先在卵表面膨大然后形成侵染釘,然后侵入卵,最后菌絲從卵里面繼續(xù)生長出來或形成孢子,淡紫擬青霉也容易侵染3齡、4齡幼蟲和雌蟲成蟲。KhanA(2006b)研究了淡紫擬青霉侵染爪哇根結線蟲、禾谷孢囊線蟲、香蕉穿孔線蟲這三種植物線蟲,淡紫擬青霉通過菌絲直接穿透爪哇根結線蟲體壁,從而侵染卵、幼蟲和成蟲;胚胎時期卵與含有幼蟲的卵相比,較易侵染。淡紫擬青霉也可以侵染體內(nèi)含有卵的早熟孢囊和香蕉穿孔線蟲,但無法侵染成熟的褐色孢囊。3.2幾丁質(zhì)酶對卵殼的活性專家學者門通過生物化學和分子生物學手段去闡明淡紫擬青霉對植物線蟲的寄生機制,一般認為淡紫擬青霉對植物線蟲的寄生機制是菌絲機械壓力和菌絲分泌的多種酶共同作用的結果。淡紫擬青霉與線蟲的孢囊或卵接觸后,菌絲頂端變粗,形成侵染釘,隨后侵染釘分泌胞外物質(zhì)(ECM)或粘性物質(zhì),在侵染釘?shù)臋C械壓力和分泌物的共同作用下,侵染釘侵入線蟲卵殼。胞外物質(zhì)(ECM)含有蛋白質(zhì)酶P23,其蛋白水解活性引起卵殼的降解。根結線蟲和孢囊線蟲卵殼由卵黃層、幾丁質(zhì)層和脂質(zhì)層組成,其主要成份是幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì),因此,幾丁質(zhì)酶和蛋白質(zhì)酶在侵染過程中起到重要作用。(HollandRJ,1999;Lopez-LlorcaLV,2008;YangJK,2007;MariaCG,2008)。普遍認為淡紫擬青霉專門寄生不動狀態(tài)的線蟲,尤其卵,但也有報道淡紫擬青霉能夠寄生活動狀態(tài)的線蟲(幼蟲和成蟲),目前尚缺少其寄生活動狀態(tài)的線蟲機制的資料(KhanA,2006b)。幾丁質(zhì)酶不僅能能降解線蟲卵殼,還能促進線蟲的孵化,同時該酶對幼蟲有一定的致死作用(肖炎農(nóng),1997)。PeterJMB(1995)研究了淡紫擬青霉與北方根結線蟲卵互作,表明淡紫擬青霉在侵染卵的過程中有裂解酶的參與;且胚胎期的卵極易受蛋白酶的破壞,而含幼蟲的卵和已孵化的幼蟲則對蛋白酶表現(xiàn)出一定的抵抗能力。KhanA(2004)用透視電鏡研究了蛋白酶和幾丁質(zhì)酶對爪哇根結線蟲孵化的影響,結果表明,蛋白酶或幾丁質(zhì)酶顯著改變卵殼結構,或使幾丁質(zhì)層變薄、或出現(xiàn)氣泡、或出現(xiàn)卵層分離,卵發(fā)生了形態(tài)學和生理學上的變化,失去完整性,無法進一步發(fā)育或孵化。4淡紫擬青霉和根結線蟲防治效果從1979年國際馬鈴薯中心的PJatala博士發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉對植物根結線蟲的寄生作用開始,此后,許多國家的專家學者對該菌進行了大量研究,證明了淡紫擬青霉對多種植物線蟲都有防治效能。但是,淡紫擬青霉作為生防制劑(BCA)在田間的使用受到多種因素的影響,如:淡紫擬青霉的種齡、毒力、存活力、接種濃度、施用方法及環(huán)境條件(土壤類型、土壤肥力、溫度、PH、寄主的易感性),防治效果還不夠穩(wěn)定(KerryBR,2000)。利用幾丁質(zhì)和淡紫擬青霉防治根結線蟲,兩者混用防治效果較單獨使用淡紫擬青霉顯著,而單獨使用幾丁質(zhì),則加重了根結線蟲病害的嚴重度(CulbreathAK,1986;MittalNG,1995)。在番茄上,同時接種淡紫擬青霉和爪哇根結線蟲,或先接種淡紫擬青霉,一周或10d后再接種線蟲,都可以有效防治根結線蟲;而先接種根結線蟲,再接種淡紫擬青霉,防治效果則不顯著(EsfahaniMN,2006;GanaieMA,2010)。淡紫擬青霉251水分散顆粒劑的防效評估試驗結果表明,種植前單獨使用淡紫擬青霉水分散顆粒劑足以防治番茄上的北方根結線蟲和南方根結線蟲;每公頃施用該商品制劑4kg,可以減少根結線蟲的孵化,劑量加倍可以進一步減少線蟲的孵化;將土壤暴曬15d后,再使用該商品制劑或只將土壤暴曬15d,防治效果都不能令人滿意。(Kiewnick,S2006a,2006b;AnastasiadisIA,2008)?；ダ采鷥?nèi)生真菌尖孢鐮刀菌和淡紫擬青霉聯(lián)合使用,用于防治溫室條件下的盆栽香蕉穿孔線蟲,可減少68.5%的線蟲密度,而單獨使用只分別減少了27.8%和54.8%,香蕉根圍中,淡紫擬青霉的存在并不影響尖孢鐮刀菌在香蕉根內(nèi)的定殖,因此,兩者可聯(lián)合使用,用于防治香蕉穿孔線蟲(AlexanderRM,2009)。在萵苣種植前兩周和種植后兩周分別使用淡紫擬青霉,線蟲的種群密度得到了控制,萵苣的重量高于空白對照,盡管如此,線蟲的種群水平還是比經(jīng)濟閥值水平高出許多(PrakobW,2009)。大棚試驗表明淡紫擬青霉麥粒菌劑和麩皮菌劑對根結線蟲病的防治效果分別為77.7%和73.3%,增產(chǎn)19.7%(肖順,200