乳酸桿菌的分離篩選及其代謝產(chǎn)物協(xié)同抑菌作用的研究

乳酸桿菌的分離篩選及其代謝產(chǎn)物協(xié)同抑菌作用的研究

20世紀(jì)40年代以后，由于抗生素在畜牧業(yè)中的廣泛應(yīng)用和顯著影響，人們對(duì)益生素的含義和應(yīng)用沒(méi)有給予充分關(guān)注。近年來(lái),英國(guó)的瘋牛病、比利時(shí)的二惡英事件和香港的瘦肉精中毒事件使消費(fèi)者對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品的安全問(wèn)題日漸關(guān)注,抗生素在飼料中添加可能引起的耐藥性、殘留和“三致”作用使益生素又重新得到了研究者和生產(chǎn)者的重視。益生素的再度興起主要是由于人們對(duì)動(dòng)物食品安全的要求提高。1908年IijaMetchnikoff發(fā)現(xiàn)保加利亞牧民長(zhǎng)壽的原因是他們有食用酸奶的習(xí)慣,他認(rèn)為酸奶中的乳酸桿菌能預(yù)防和治療多種疾病。隨后在20世紀(jì)前半葉,嗜酸乳酸桿菌廣泛地應(yīng)用于食品行業(yè)。自然界存在的乳酸桿菌至今未發(fā)現(xiàn)有致病作用的菌株,美國(guó)FDA和AAFCO在1989年公布的安全微生物品種共43種,其中乳酸桿菌占12種,中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部1999年公布允許使用的12種飼用微生物中有3種是乳酸桿菌。在美國(guó),益生素工業(yè)上應(yīng)用的產(chǎn)品57%含有乳酸桿菌屬。何明清,等(1986)對(duì)病、健仔豬腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn),腹瀉仔豬腸道中的乳酸桿菌數(shù)量顯著下降,大腸桿菌數(shù)顯著上升。使用乳酸桿菌益生素可以調(diào)整胃腸道微生態(tài)平衡,所以乳酸桿菌類(lèi)益生素將是很有前途的防治仔豬腹瀉的制劑。仔豬在生長(zhǎng)早期容易患大腸桿菌性疾病,根據(jù)報(bào)道致病性大腸桿菌的主要血清型是K88、K99和987P,因此應(yīng)用體外法測(cè)定乳酸桿菌抑制大腸桿菌的能力是評(píng)價(jià)乳酸桿菌益生作用的一項(xiàng)很有價(jià)值的指標(biāo)。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定乳酸桿菌的乳酸產(chǎn)量、采用平皿挖溝法測(cè)定其代謝產(chǎn)物對(duì)不同血清型大腸桿菌的抑制能力及用濃度梯度法測(cè)定乳酸桿菌菌體和代謝產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的協(xié)同抑制作用。1材料和方法1.1ph、n、n-fmo乳酸桿菌培養(yǎng)基:MRS肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨,10g;牛肉浸膏,10g;酵母浸粉,5g;磷酸氫二鉀,2g;枸椽酸二銨,2g;葡萄糖,20g;七水硫酸鎂,0.58g;蒸餾水,1000ml;用1mol/LNaOH調(diào)pH到7.0)。3種血清型的大腸桿菌(K88、K99和987P)均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。乳酸桿菌:3株分離自21日齡斷奶后健康仔豬的胃粘膜上皮。大腸桿菌培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)肉湯(購(gòu)自上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所試劑廠)。檢測(cè)大腸桿菌的培養(yǎng)基;麥康凱(MacConkay)培養(yǎng)基(購(gòu)自北京天壇生物制品股份有限公司)。大腸桿菌在麥康凱瓊脂上長(zhǎng)成紅色菌落。1.2菌種距離檢測(cè)乳酸桿菌培養(yǎng)液:每個(gè)亨蓋氏(Hungates)管里加MRS肉湯約15ml,然后充二氧化碳,用0.1%新配的刃天青溶液作氧指示劑,無(wú)氧時(shí)刃天青呈無(wú)色。加蓋后在高壓蒸汽滅菌鍋里經(jīng)121℃保持15分鐘,制成無(wú)菌厭氧MRS肉湯。待涼下來(lái)后接種從健康仔豬胃里分離的3株乳酸桿菌,接種量為1%(約107CFU/ml),在37℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24小時(shí)后,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ樗岬臏y(cè)定:取2ml乳酸桿菌培養(yǎng)液,15000r/min離心15分鐘,取上清液,用超純水稀釋后在TehniconRH100生化分析儀上測(cè)定。抑制大腸桿菌試驗(yàn):A:制作麥康凱培養(yǎng)基,無(wú)菌操作傾倒平皿,每個(gè)平皿的培養(yǎng)基厚度約為6mm。用記號(hào)筆在平皿底部劃線將平皿分成三個(gè)平行的區(qū)域,每個(gè)區(qū)域用接種棒劃線接種大腸桿菌培養(yǎng)液(4.0×108CFU/ml)于培養(yǎng)基表面,然后在距平皿中線約4cm的地方挖一寬為1cm的溝,與劃線的培養(yǎng)物垂直,如圖1所示。分別用3株不同的乳酸桿菌培養(yǎng)物將溝填滿(不能溢出),置普通培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18小時(shí)后,觀察測(cè)定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離。B:根據(jù)A試驗(yàn)的結(jié)果,選擇其中一株乳酸桿菌,取5ml該乳酸桿菌培養(yǎng)物(8.2×109CFU/ml)分別與5、10、15ml營(yíng)養(yǎng)肉湯混合,制成3個(gè)含不同乳酸桿菌培養(yǎng)物濃度的營(yíng)養(yǎng)肉湯,接種大腸桿菌,接種量為培養(yǎng)液的5%,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4、8和18個(gè)小時(shí)后,分別用無(wú)菌注射器取出培養(yǎng)液,培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋成10-2~10-5后,每個(gè)稀釋度作4個(gè)平行樣,取0.3ml稀釋液,用接種棒均勻涂布于麥康凱瓊脂平板上,置37℃,普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)18個(gè)小時(shí),取菌落數(shù)在50~150個(gè)的平皿計(jì)數(shù),取平均值,計(jì)算每毫升培養(yǎng)液中大腸桿菌的數(shù)量。2結(jié)果與討論2.1表1顯示了24小時(shí)后對(duì)乳酸桿菌菌進(jìn)行栽培的牛奶量乳酸是乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物之一,據(jù)報(bào)道乳酸是乳酸桿菌代謝產(chǎn)物中對(duì)大腸桿菌起抑制作用的主要成分。2.2離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離平皿挖溝法抑菌試驗(yàn)的原理與平皿挖孔法相似,是由于放置于溝中的抗菌物質(zhì)能滲透過(guò)瓊脂來(lái)達(dá)到對(duì)大腸桿菌的抑制作用,隨著離溝距離的增大,能滲透過(guò)去的抗菌物質(zhì)的濃度就越小。所以乳酸桿菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌的效果以離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離為指標(biāo),距離越大,說(shuō)明其代謝產(chǎn)物所含抗菌物質(zhì)的抑菌效果越好,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出,本試驗(yàn)所用3株乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌K88和K99都有很強(qiáng)的抑制作用,而對(duì)987P的抑制作用較弱,乳酸桿菌3甚至對(duì)987P沒(méi)有抑制作用。結(jié)果表明,乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物對(duì)不同血清型大腸桿菌的抑制作用有一定的差別。結(jié)合表1和2的結(jié)果可以認(rèn)為,乳酸產(chǎn)量相近的乳酸桿菌對(duì)同一血清型大腸桿菌的抑制作用存在差異,可以推斷,乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物中對(duì)大腸桿菌起抑制作用的成分不止乳酸一種,但乳酸可降低培養(yǎng)基pH值,這可能會(huì)增強(qiáng)乳酸桿菌分泌的其它成分如細(xì)菌素、過(guò)氧化氫等對(duì)大腸桿菌的抑制作用。2.3乳酸桿菌對(duì)不同血清型大腸桿菌的抑制作用從表3可以看出,乳酸桿菌培養(yǎng)物占肉湯50%時(shí),經(jīng)過(guò)4小時(shí)培養(yǎng)后,大腸桿菌數(shù)量下降了40~60倍,再經(jīng)過(guò)4小時(shí)的培養(yǎng),大腸桿菌的數(shù)量下降得更快,K88下降近4000倍,K99下降近2000倍,987P下降近100倍,共培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)之后,在培養(yǎng)液里已檢測(cè)不出大腸桿菌,說(shuō)明大腸桿菌已全部被殺死。不同血清型的大腸桿菌在含1/2乳酸桿菌培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)肉湯中數(shù)量下降速度不同,說(shuō)明在含50%乳酸桿菌培養(yǎng)液的肉湯中,乳酸桿菌對(duì)不同血清型大腸桿菌具有不同的抑制作用。乳酸桿菌培養(yǎng)物含量為1/3和1/4的肉湯中,經(jīng)過(guò)4小時(shí)培養(yǎng)后,大腸桿菌數(shù)量分別下降了25倍和15倍左右,再經(jīng)過(guò)4小時(shí)的培養(yǎng),大腸桿菌的數(shù)量下降得更快,三種大腸桿菌都下降近1000倍,共培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)之后,在培養(yǎng)液里已沒(méi)有大腸桿菌,說(shuō)明大腸桿菌已全部被殺死。不同血清型的大腸桿菌在同樣濃度的乳酸桿菌培養(yǎng)物中數(shù)量下降速度基本相同,說(shuō)明在含1/3和1/4乳酸桿菌培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,乳酸桿菌對(duì)不同血清型大腸桿菌的抑制作用基本相同,抑菌作用比含50%的乳酸桿菌培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)肉湯時(shí)較弱,但18小時(shí)之后的抑菌效果是一樣的。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),大腸桿菌數(shù)量下降的速度加快,可能是在培養(yǎng)初期乳酸桿菌的主要作用是抑制大腸桿菌,而在后期則主要是殺菌作用。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸桿菌的生長(zhǎng)及其代謝產(chǎn)物的積累提高了其殺