植物寄生線蟲(chóng)生物殺線蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

植物寄生線蟲(chóng)生物殺線蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

作物原生動(dòng)物線蟲(chóng)嚴(yán)重受損，世界每年因植物原生動(dòng)物屈原造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)1570億元。在我國(guó),病原線蟲(chóng)引起的病害已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中僅次于真菌病害的第二大類病害,尤其是小麥和大豆孢囊線蟲(chóng),蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)經(jīng)常流行成災(zāi),嚴(yán)重威脅我國(guó)糧、經(jīng)作物安全。長(zhǎng)期以來(lái),線蟲(chóng)的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥。但由于殺線蟲(chóng)化學(xué)農(nóng)藥高毒性,過(guò)度依賴以及長(zhǎng)期不合理使用,導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品殘留和農(nóng)田生態(tài)問(wèn)題日益突出。因此,利用食線蟲(chóng)微生物資源開(kāi)發(fā)生物殺線蟲(chóng)劑的研究受到普遍重視。食線蟲(chóng)微生物(nematophagousmicroorganisms)是指一類能夠侵染、捕捉和毒殺線蟲(chóng)的微生物類群,是自然界中線蟲(chóng)種群控制的重要因子,也是生物防治病原線蟲(chóng)的重要研究材料,具有特殊的研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái),科學(xué)家們不僅利用分子生物學(xué)手段對(duì)食線蟲(chóng)微生物侵染線蟲(chóng)的分子機(jī)制開(kāi)展了廣泛的研究,還針對(duì)豐富的食線蟲(chóng)微生物資源及次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了挖掘,取得了一些重要進(jìn)展。本文綜述了以上研究進(jìn)展并簡(jiǎn)述了食線蟲(chóng)微生物資源的生物防治應(yīng)用現(xiàn)狀。1菌sq指數(shù)食線蟲(chóng)微生物包括食線蟲(chóng)真菌和食線蟲(chóng)細(xì)菌兩大類。食線蟲(chóng)真菌又被劃分為線蟲(chóng)內(nèi)寄生真菌(endoparasiticnematophagousfungi)和捕食線蟲(chóng)真菌(nematode-trappingfungi)。1.1捕捉線蟲(chóng)菌1.1.1天敵改種和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)捕食線蟲(chóng)真菌(nematode-trappingfungi)是指以營(yíng)養(yǎng)菌絲特化形成的粘性菌絲、粘性分枝、粘性球、粘性網(wǎng)、非收縮環(huán)及收縮環(huán)等捕食器官捕捉線蟲(chóng)的真菌。迄今為止,據(jù)國(guó)際真菌權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)MycoBank記載,全世界已報(bào)道的捕食線蟲(chóng)真菌有347種,而我國(guó)已報(bào)道的種類約有140種。自上世紀(jì)80年代以來(lái),我國(guó)學(xué)者報(bào)道的捕食線蟲(chóng)絲孢菌104種,其中新種為73個(gè)[5~13]。自Corda于1839年根據(jù)模式種Arthrobotryssuperba建立Arthrobotrys屬以來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者在捕食線蟲(chóng)真菌的分類及資源研究領(lǐng)域進(jìn)行了大量研究。早期傳統(tǒng)的分類學(xué)家們依據(jù)分生孢子的形態(tài)、大小、分隔及著生方式,分生孢子梗頂端的瘤節(jié)、捕食器官和厚垣孢子等形態(tài)學(xué)特征,將捕食線蟲(chóng)真菌鑒定為Arthrobotrys,Dactylella和Monacrosporium3個(gè)屬。而近年來(lái),依靠核糖體RNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明,捕食線蟲(chóng)真菌在環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中特化出來(lái)的捕食器官類型在屬級(jí)分類上能提供更多的信息,更能反映捕食線蟲(chóng)真菌物種間的相互關(guān)系[15~18]。而我國(guó)學(xué)者根據(jù)28SrDNA、5.8SrDNA和β-tubulin基因序列分析結(jié)果重新修訂了捕食線蟲(chóng)真菌的分類系統(tǒng),提出了以捕食器官作為分屬特征的新分類系統(tǒng),即產(chǎn)生粘性菌網(wǎng)的Arthrobotrys,產(chǎn)生粘球的以及既產(chǎn)生有柄粘球又產(chǎn)生非收縮環(huán)的Dactylellina和產(chǎn)生收縮環(huán)的Drechslerella。1.1.2食蟲(chóng)真菌的祖世系統(tǒng)捕食器官是捕食線蟲(chóng)真菌從腐生階段過(guò)渡到寄生階段的標(biāo)志,也是該類真菌對(duì)線蟲(chóng)實(shí)施有效捕捉的重要工具。Li等曾根據(jù)28SrDNA、5.8SrDNA和β-tubulin基因的分析,提出了捕食器進(jìn)化的模型,認(rèn)為粘球是捕食線蟲(chóng)真菌捕食器官中較為原始的結(jié)構(gòu),粘球形成之后,捕食器官開(kāi)始兩條進(jìn)化路徑,一條通過(guò)保留粘性物質(zhì),由粘球進(jìn)化形成二維粘性分支,最終進(jìn)化形成復(fù)雜的三維菌網(wǎng)結(jié)構(gòu)。另一條則是粘球在進(jìn)化中逐漸丟失了分泌粘性物質(zhì)的能力,但捕食器官結(jié)構(gòu)卻逐漸延伸,最終其末端與起始部位結(jié)合,形成非收縮環(huán);非收縮環(huán)再逐漸進(jìn)化形成由3個(gè)細(xì)胞組成的收縮環(huán)結(jié)構(gòu)。然而,Yang等則依據(jù)RPB2、EF1-α、β-tubulin和ITS序列分析,對(duì)捕食線蟲(chóng)真菌捕食器官的進(jìn)化路徑提出了另一個(gè)假說(shuō),他們認(rèn)為捕食器官的祖先結(jié)構(gòu)通過(guò)其中一條路徑形成了收縮環(huán);另一條路徑形成具有粘性物質(zhì)的捕食器官(如,三維菌網(wǎng)和粘球等),在這一進(jìn)化路徑中,粘性三維菌網(wǎng)以一個(gè)非常穩(wěn)定且緩慢的速度從其祖先粘性結(jié)構(gòu)(二維粘性分枝)進(jìn)化而來(lái),而粘球主要是通過(guò)菌絲的延長(zhǎng)而逐漸形成,并最終進(jìn)化為非收縮環(huán)。2012年,Yang等通過(guò)選取代表6種捕食結(jié)構(gòu)的16種捕食線蟲(chóng)真菌的5個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因片段進(jìn)行分析,結(jié)合相關(guān)的化石證據(jù)和分子鐘計(jì)算,推測(cè)捕食線蟲(chóng)真菌的祖先可能起源于4.19億年前;在2.46億年前,主動(dòng)類的收縮環(huán)捕食結(jié)構(gòu)和被動(dòng)類的粘性捕食結(jié)構(gòu)發(fā)生分化;而粘性捕食結(jié)構(gòu)在1.98—2.08億年之間快速分化并形成現(xiàn)存捕食結(jié)構(gòu)的主要分支。而基于捕食結(jié)構(gòu)為收縮環(huán)的Drechslerellastenobrocha基因組數(shù)據(jù),通過(guò)獨(dú)立的時(shí)間校正點(diǎn)對(duì)1069個(gè)同源蛋白序列分析,推測(cè)主動(dòng)類的收縮環(huán)捕食結(jié)構(gòu)和被動(dòng)類的粘性捕食結(jié)構(gòu)的分化事件在2.60億年前,與上述分析結(jié)果高度接近。由于捕食性子囊菌兩次重大分化事件的發(fā)生接近于2.51億年前的二疊紀(jì)-三疊紀(jì)物種大滅絕事件和2.01億年前的三疊紀(jì)-侏羅紀(jì)物種大滅絕事件,研究人員進(jìn)而推測(cè)物種大滅絕所導(dǎo)致的大量有機(jī)物,促使線蟲(chóng)大量繁衍,而真菌為了獲取氮源以及在惡劣環(huán)境壓力脅迫下,可能驅(qū)動(dòng)了子囊菌捕食能力的進(jìn)化。該研究為真菌在極端環(huán)境下的適應(yīng)性進(jìn)化提供了新的理論。1.2昆蟲(chóng)的繁殖內(nèi)寄生線蟲(chóng)真菌(endoparasiticnematophagousfungi)是通過(guò)產(chǎn)生游動(dòng)孢子或粘性孢子黏附于線蟲(chóng)或線蟲(chóng)卵上,然后通過(guò)孢子萌發(fā)侵入蟲(chóng)體或卵的內(nèi)部,或者當(dāng)線蟲(chóng)將分生孢子吞入食道或胃中時(shí),分生孢子便在蟲(chóng)體消化道內(nèi)萌發(fā)產(chǎn)生內(nèi)生性菌絲,進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,并吸食蟲(chóng)體內(nèi)容物,使線蟲(chóng)致死。迄今為止,內(nèi)寄生線蟲(chóng)真菌包括150多個(gè)物種,我國(guó)報(bào)道20余種,代表屬有串孢壺菌屬M(fèi)yzocytium、掘氏梅里霉屬Drechmeria、毒蟲(chóng)霉屬Nematoctonus、擬青霉屬Paecilomyces、被毛孢屬Hirsutella和鉤絲孢屬Harposporium等。目前,對(duì)于內(nèi)寄生線蟲(chóng)真菌侵染線蟲(chóng)的分子生物學(xué)研究大多局限在從該類真菌中分離并鑒定一些參與線蟲(chóng)侵染的基因,并獲知內(nèi)寄生線蟲(chóng)真菌能利用這些基因先將線蟲(chóng)體壁進(jìn)行降解,破壞其完整性,從而完成對(duì)線蟲(chóng)的成功侵染[26~31]。雖然對(duì)內(nèi)寄生線蟲(chóng)真菌侵染線蟲(chóng)的分子機(jī)制知之甚少,但已經(jīng)有不少公司將部分內(nèi)寄生線蟲(chóng)真菌制作成商品化菌劑。如,菲律賓亞州技術(shù)中心將內(nèi)寄生線蟲(chóng)真菌淡紫擬青霉商品化BIOCON出售;在國(guó)內(nèi),華遠(yuǎn)豐農(nóng)(北京)生物科技有限公司以100億活孢子·克-1制劑推出的淡紫擬青霉瓶裝制劑等。1.3病毒類細(xì)菌食線蟲(chóng)細(xì)菌(nematophagousbacteria)是指能寄生、附著或者通過(guò)分泌毒力蛋白對(duì)線蟲(chóng)具有一定毒殺作用的細(xì)菌類群,這類細(xì)菌在物種、分布以及宿主范圍上均存在多樣性。目前研究得較為深入的食線蟲(chóng)細(xì)菌主要包括芽胞桿菌Bacillus、巴氏桿菌Pasteurella和假單胞菌Pseudomonas等。1.3.1bt伴胞晶體蛋白的免疫作用芽胞桿菌是土壤根際微生物中最常見(jiàn)的種類,在芽胞桿菌所報(bào)道的13個(gè)屬223個(gè)種中,對(duì)線蟲(chóng)有抑制活性的芽胞桿菌至少有20種,這些芽胞桿菌的殺線蟲(chóng)機(jī)制也存在較大差異。1961年,Giordia和Bizzell首次發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)對(duì)牛腸道蛇形毛圓線蟲(chóng)Trichostrongyluscolubriformis的卵和幼蟲(chóng)具有滅殺作用。1972年,Prasad等最先發(fā)現(xiàn)Bt的β-外毒素對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的卵和幼蟲(chóng)有較高的毒殺活性。隨后,Bone等發(fā)現(xiàn)Bt伴胞晶體蛋白對(duì)線蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性。目前,所報(bào)道的Bt中對(duì)線蟲(chóng)有毒性的基因主要有cry5Aa、cry5Ba、cry6Aa、cry6Ba、cry12A、cry13A、cry14A、cry21A等。這些基因編碼的晶體蛋白具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。Marroquin等推測(cè)Bt伴胞晶體蛋白作用線蟲(chóng)的機(jī)制可能與作用于昆蟲(chóng)的方式相似,線蟲(chóng)吞入的晶體蛋白與線蟲(chóng)腸道內(nèi)膜結(jié)合引起腸內(nèi)膜滲透壓增大,從而破壞了線蟲(chóng)腸道組織,導(dǎo)致線蟲(chóng)致死。美國(guó)加州大學(xué)的Aroian小組在研究殺線蟲(chóng)Bt晶體蛋白與秀麗隱桿線蟲(chóng)相互作用關(guān)系時(shí),發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)細(xì)胞膜上的糖脂為晶體蛋白作用的受體,糖脂含一個(gè)四糖分子(tetrasaccharide),他們已經(jīng)鑒定了編碼糖脂糖基轉(zhuǎn)移酶(BRE)的基因中的幾個(gè)突變等位基因,由于不能表達(dá)正常的糖基轉(zhuǎn)移酶,糖脂失去四糖分子,受體不能正常與晶體蛋白結(jié)合,導(dǎo)致線蟲(chóng)產(chǎn)生抗性。然而,正是由于植物寄生線蟲(chóng)體腔溶液不能溶解蘇云金芽胞桿菌的伴胞晶體,從而限制了蘇云金芽胞桿菌殺線蟲(chóng)制劑的直接施用。另外,云南大學(xué)對(duì)1株從土壤中篩選到的芽胞桿菌新種BacillusnematocidaB16進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)了該菌利用獨(dú)特的“特洛伊”木馬機(jī)制侵染線蟲(chóng),該研究成果對(duì)微生物侵染宿主領(lǐng)域的知識(shí)作了重要的增補(bǔ),極大地拓展了人們對(duì)細(xì)菌致病機(jī)制的了解。1.3.2關(guān)于根結(jié)線蟲(chóng)的防治巴氏桿菌是植物病原線蟲(chóng)的專性寄生細(xì)菌,其分布非常廣泛,專性寄生線蟲(chóng)的2齡幼蟲(chóng)。目前已明確的植物寄生線蟲(chóng)的巴氏桿菌屬病原物主要有3個(gè)種,分別是穿刺巴氏桿菌Pasteuriapentrans,主要寄生根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogynespp.;Pasteuriathornei,主要寄生于短體線蟲(chóng)Pratylenchusspp.和根結(jié)線蟲(chóng);Pasteurianishizawae,主要寄生于形成胞囊類線蟲(chóng)。在這3種巴氏桿菌中,穿刺巴氏桿菌對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)有非常好的防治效果,其作用方式是以球形孢子黏附于線蟲(chóng)體表,受侵染的2齡幼蟲(chóng)侵入根系后,隨線蟲(chóng)的發(fā)育,細(xì)菌不斷在線蟲(chóng)體內(nèi)繁殖,當(dāng)線蟲(chóng)發(fā)育到成蟲(chóng)時(shí),其體內(nèi)充滿的細(xì)菌可導(dǎo)致其徹底被摧毀,并釋放大量的穿刺巴氏桿菌到土壤中,開(kāi)始另一個(gè)循環(huán)周期。該菌的孢子抗干旱,在干燥條件下可存活幾年,具有極為重要的生物防治價(jià)值。近年來(lái),用穿刺巴氏桿菌防治作物根結(jié)線蟲(chóng)病的研究非常多,但大多數(shù)研究是在溫室中或小范圍試驗(yàn)區(qū)中完成的,進(jìn)入田間小區(qū)試驗(yàn)的很少。從目前的研究可以看出,無(wú)論單獨(dú)施用還是與某些殺線蟲(chóng)劑混合施用,穿刺巴氏桿菌對(duì)作物上發(fā)生的多種根結(jié)線蟲(chóng)病都有明顯的防治作用。然而,由于其專性寄生性導(dǎo)致不能在人工合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng),必須依賴線蟲(chóng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,而線蟲(chóng)的生長(zhǎng)又必須通過(guò)寄主植物來(lái)實(shí)現(xiàn),這種多重寄生關(guān)系嚴(yán)重的限制巴氏桿菌的規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。1.3.3插裝菌的毒性因子假單胞菌對(duì)植物病原線蟲(chóng)的防治研究主要集中在銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa中。銅綠假單胞菌,也稱綠膿桿菌,是一種普遍存在的革蘭氏陰性菌,喜好潮濕的環(huán)境,對(duì)養(yǎng)分要求極為簡(jiǎn)單,有鞭毛,可運(yùn)動(dòng),菌落呈粘稠狀。由于該菌大規(guī)模分泌表面相關(guān)性的毒性因子及調(diào)控這些毒性因子產(chǎn)生的途徑極為復(fù)雜,使得該菌具有很寬的宿主范圍,包括細(xì)菌、植物、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)及哺乳動(dòng)物等。Gallagher和Manoil描述了銅綠假單孢菌PA01快速麻痹并殺死線蟲(chóng)C.elegans的一種模式,PA01產(chǎn)生的氰化氫是致死線蟲(chóng)的唯一或者主要的毒性因子。線蟲(chóng)的這種麻痹性死亡不僅由感官調(diào)控系統(tǒng)所控制,激活線蟲(chóng)的egl-9基因也可導(dǎo)致線蟲(chóng)的麻痹。Wareham等研究了銅綠假單胞菌3型分泌系統(tǒng)(TTSS)在侵染線蟲(chóng)C.elegans中的作用,通過(guò)測(cè)試菌株P(guān)A14及其突變株P(guān)A14exsA的殺線蟲(chóng)效率,認(rèn)為T(mén)TSS并不是關(guān)鍵的致病因子,從分子水平上研究了這些毒力因子的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,為運(yùn)用基因工程技術(shù)進(jìn)行線蟲(chóng)生防菌株的遺傳改造和高毒力殺線蟲(chóng)制劑的開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。2食線蟲(chóng)微生物和線蟲(chóng)相互作用上世紀(jì)90年代以來(lái),隨著基因克隆等分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展,科學(xué)家逐漸從基因和蛋白質(zhì)水平研究食線蟲(chóng)微生物和線蟲(chóng)之間的相互作用,并取得了一些研究成果。2.1吃線蟲(chóng)的真菌污染實(shí)際上是興國(guó)線的分子機(jī)制2.1.1食線蟲(chóng)真菌體壁降解酶系統(tǒng)1994年,瑞典學(xué)者最先從食線蟲(chóng)真菌寡孢節(jié)叢孢中分離得到一種胞外絲氨酸蛋白酶PII,并證實(shí)該蛋白酶能夠降解線蟲(chóng)的體壁,是侵染線蟲(chóng)的重要毒力因子之一。1996年,克隆了PII編碼基因,構(gòu)建了具有更快捕食速度和殺死線蟲(chóng)能力的PII基因多拷貝菌株。隨后,研究人員又陸續(xù)從其它食線蟲(chóng)真菌中純化出體壁降解蛋白酶并進(jìn)行了相關(guān)基因的克隆。2000年以來(lái),國(guó)內(nèi)的科研人員在食線蟲(chóng)真菌體壁降解酶的研究也取得了重大的進(jìn)展,其中以云南大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院微生物研究所為代表,他們對(duì)食線蟲(chóng)真菌侵染性體壁降解蛋白酶的純化和基因克隆等方面做了大量系統(tǒng)的工作。迄今為止,已經(jīng)從多種不同侵染類型的食線蟲(chóng)真菌中純化得到體壁降解蛋白酶并克隆了相應(yīng)的編碼基因,如克隆自Arthrobotrysoligospora的PII和AozI,克隆自刀孢輪枝菌Verticilliumpsalliotae的Ver112、粉紅螺旋聚孢霉Clonostachysrosea的PrC、異型隔指孢Dactylellavarietas的Dv1、圓錐節(jié)叢胞Arthrobotrysconoides的Ac1、小舟單頂孢M(jìn).microscaphoides的Mlx、洛和斯里被毛孢Hirsutellarhossiliensis的Hnsp等[50~57]。此外,對(duì)該類體壁降解蛋白酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,來(lái)源于捕食線蟲(chóng)真菌的蛋白酶聚類成一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支,并且在進(jìn)化的早期受到了正選擇作用,有利于降解線蟲(chóng)體壁蛋白功能的積累;而內(nèi)寄生真菌產(chǎn)生的蛋白酶則和昆蟲(chóng)病原真菌的蛋白酶聚類在一個(gè)進(jìn)化分支,表明這些真菌可能具有同時(shí)侵染線蟲(chóng)和昆蟲(chóng)的能力,該結(jié)果為研究和開(kāi)發(fā)雙功能生防菌劑奠定了理論基礎(chǔ)。2.1.2paa和prc對(duì)pa-c表達(dá)的調(diào)控云南大學(xué)對(duì)食線蟲(chóng)真菌粉紅螺旋聚孢霉C.rosea體壁降解蛋白酶PrC的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了深入的研究。PrC是粉紅螺旋聚孢霉降解線蟲(chóng)體壁的主要毒力因子,具有降解線蟲(chóng)的能力。通過(guò)添加優(yōu)先氮源與非優(yōu)先氮源培養(yǎng)粉紅螺旋聚孢霉,使用Real-TimePCR分析PrCmRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)先氮源如谷氨酰胺可以抑制PrC的組成型表達(dá),其抑制效應(yīng)與谷氨酰胺的濃度成正比,1%的濃度可以完全抑制。同樣,使用銨鹽也可以抑制PrC的表達(dá)。使用雷帕霉素受體(TOR)抑制劑雷帕霉素(rapamycin)可以解除這種抑制。在培養(yǎng)基中加入PMSF抑制組成型表達(dá)的PrC活性可以抑制線蟲(chóng)體壁對(duì)PrC的誘導(dǎo),但對(duì)組成型表達(dá)水平無(wú)影響。啟動(dòng)子報(bào)告基因試驗(yàn)和凝膠遷移率試驗(yàn)(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)研究表明氮源對(duì)PrC組成型表達(dá)和誘導(dǎo)型的表達(dá)調(diào)控分別發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和后轉(zhuǎn)錄水平。另外,研究發(fā)現(xiàn)粉紅螺旋聚孢霉在侵染線蟲(chóng)的早期,paaC基因提高了表達(dá)。敲除paaC基因后,粉紅螺旋聚孢霉在堿性pH環(huán)境下生長(zhǎng)速度降低,菌絲形態(tài)發(fā)生變化,產(chǎn)孢率和侵染線蟲(chóng)的能力明顯下降。蛋白酶PrC在堿性條件比酸性條件中具有更高的表達(dá),而且在PaaC突變子中PrC的表達(dá)水平下降。通過(guò)啟動(dòng)子活性分析和EMSA試驗(yàn)表明PrC在轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)PacC途徑受到環(huán)境pH的調(diào)控。此外,蛋白酶PrC同樣受到環(huán)境脅迫的調(diào)控。在氧化劑和熱休克條件下,PrC的轉(zhuǎn)錄水平提高,同時(shí)發(fā)現(xiàn)在線蟲(chóng)存在的情況下,粉紅螺旋聚孢霉野生菌株經(jīng)過(guò)氧化劑和熱休克處理的分生孢子比PrC敲除菌株的分生孢子具有更高的萌發(fā)率,而PrC降解線蟲(chóng)體壁產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物可以抑制氧化劑與熱休克條件下孢子的萌發(fā)。此外,加入線蟲(chóng)體壁可以降低野生菌株產(chǎn)生的活性氧量,而突變菌株則沒(méi)有影響。由此可見(jiàn),蛋白酶PrC具有保護(hù)真菌抵御氧脅迫的作用。其降解線蟲(chóng)體壁產(chǎn)生的小分子物質(zhì)通過(guò)消除活性氧自由基起到保護(hù)作用。2.1.3結(jié)構(gòu)比對(duì)降解線蟲(chóng)體壁的影響體壁降解蛋白酶在食線蟲(chóng)真菌侵染線蟲(chóng)的過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用,是重要的毒力因子。因此人們?cè)诳寺×说鞍酌妇幋a基因的基礎(chǔ)上展開(kāi)了高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究。首先是以現(xiàn)有絲氨酸蛋白酶家族中的晶體結(jié)構(gòu),如蛋白酶K的結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行同源模建,隨后通過(guò)X-射線晶體衍射的方法獲得了精確的三維結(jié)構(gòu),并在此基礎(chǔ)上對(duì)一系列體壁降解蛋白酶進(jìn)行了同源模建,通過(guò)結(jié)構(gòu)比較,重點(diǎn)研究了二硫鍵和蛋白酶分子表面電勢(shì)對(duì)降解線蟲(chóng)體壁的影響。Liang等解析了刀孢輪枝菌及淡紫擬青霉的胞外蛋白酶Ver112和PL646的晶體結(jié)構(gòu),它們的結(jié)構(gòu)與蛋白酶K較為相似,主要差別在于底物結(jié)合口袋S1和S4處存在一定的氨基酸殘基的變化,引起3個(gè)蛋白酶的底物結(jié)合口袋大小和親疏水性的變化,導(dǎo)致它們對(duì)多肽底物殘基P1和P4結(jié)合偏好性的變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶的表面電勢(shì)和二硫鍵是影響不同蛋白酶水解線蟲(chóng)體壁活性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2.1.4寡孢節(jié)叢孢基因組的基本特征隨著高通量技術(shù)的發(fā)展,使得人們對(duì)食線蟲(chóng)真菌侵染過(guò)程中大量基因變化的研究成為可能。Ahrén等通過(guò)Microarray技術(shù)對(duì)堅(jiān)粘孢單頂孢M(jìn)onacrosporiumhaptotylum的粘球和營(yíng)養(yǎng)菌絲的差異表達(dá)基因分析,發(fā)現(xiàn)有23.3%的基因在捕食器官中特異性表達(dá)。Fekete等研究發(fā)現(xiàn),堅(jiān)粘孢單頂孢在侵染秀麗隱桿線蟲(chóng)的粘附、穿透和消化等不同階段中,真菌的基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著的變化。2011年,云南大學(xué)率先對(duì)寡孢節(jié)叢孢的全基因組進(jìn)行了測(cè)序。寡孢節(jié)叢孢基因組的基本特征如下:基因組大小為40.07Mb,編碼區(qū)占了全基因組的48.5%,GC含量為44.5%,基因的平均長(zhǎng)度為1.69kb,內(nèi)含子的平均長(zhǎng)度為89bp,外顯子的平均長(zhǎng)度為473bp,tRNA的數(shù)目為145個(gè)。基因組編碼11479個(gè)基因,其中23.6%的基因?qū)儆诙嗷蚣易?44.6%的基因和COG/KOG數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配。與其它測(cè)序的真菌相比,寡孢節(jié)叢孢的基因組中存在大量和致病相關(guān)的基因家族,包括枯草桿菌素蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、果膠酯酶和纖維二糖水解酶等。為了進(jìn)一步了解寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官的分子機(jī)制,使用雙向電泳技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)鑒定了線蟲(chóng)誘導(dǎo)10h和48h寡孢節(jié)叢孢三維菌網(wǎng)和營(yíng)養(yǎng)菌絲的基因表達(dá)差異。通過(guò)全基因組測(cè)序以及比較基因組學(xué)、生物信息學(xué)和蛋白組學(xué)的有機(jī)結(jié)合,該團(tuán)隊(duì)提出了該類真菌從腐生到寄生的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),認(rèn)為在線蟲(chóng)誘導(dǎo)的條件下,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、蛋白質(zhì)翻譯、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、細(xì)胞壁合成等生物學(xué)途徑的基因和蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào),說(shuō)明這些表達(dá)量上調(diào)的蛋白可能參與寡孢節(jié)叢孢捕器的形成。寡孢節(jié)叢孢識(shí)別線蟲(chóng),并通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)把胞外信號(hào)傳遞到胞內(nèi)進(jìn)一步激活下游的生物學(xué)過(guò)程,多種生物學(xué)途徑的合作導(dǎo)致捕食器官形成。寡孢節(jié)叢孢作為第一個(gè)被測(cè)序的無(wú)脊椎動(dòng)物病原真菌,它的基因組將會(huì)為詮釋捕食線蟲(chóng)真菌的進(jìn)化、侵染機(jī)制和高效生防菌株的構(gòu)建鑒定基礎(chǔ),為微生物從腐生到致病的生活史轉(zhuǎn)換理論做出貢獻(xiàn)。2.2特洛伊木馬來(lái)誘線蟲(chóng)云南大學(xué)從土壤中篩選出1株具有較強(qiáng)殺線蟲(chóng)活性的枯草芽孢桿菌新種BacillusnematocidaB16。他們針對(duì)野生型和敲除毒力的突變型菌株開(kāi)展了一系列試驗(yàn),在倒扣平板試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),相對(duì)于普通的大腸桿菌,B16菌株具有較強(qiáng)的吸引線蟲(chóng)的能力,原因在于該細(xì)菌能釋放芳香的揮發(fā)性物質(zhì),如苯甲醛和2-庚酮等來(lái)引誘線蟲(chóng)。有趣的是,細(xì)菌使用的這種“詭計(jì)”和古希臘神化故事“特洛伊戰(zhàn)爭(zhēng)”中用于引誘敵人的“特洛伊木馬”策略具有異曲同工之妙,引誘線蟲(chóng)的芳香物質(zhì)是細(xì)菌使用常規(guī)的生物合成途徑產(chǎn)生的,這種進(jìn)化上的“詭計(jì)”能夠在最大程度上降低細(xì)菌的能耗。細(xì)菌通過(guò)偽裝進(jìn)入了“敵人”線蟲(chóng)的體內(nèi),緊接著在線蟲(chóng)的體內(nèi)分泌毒力極強(qiáng)的胞外蛋白酶Bace16和Bae16侵染線蟲(chóng)。該研究通過(guò)蛋白質(zhì)的異源/同源表達(dá)、基因敲除、熒光蛋白定位、顯微注射等一系列功能試驗(yàn),確定了這些胞外蛋白酶在侵染中發(fā)揮的協(xié)同作用和侵染靶點(diǎn),證實(shí)了腸道損傷是導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡的主要原因。另外,這些胞外蛋白酶很可能降解一些維持線蟲(chóng)生命的蛋白質(zhì),如肌球蛋白、ATP酶相關(guān)蛋白等,加速了線蟲(chóng)的死亡。同時(shí),為確證殺線蟲(chóng)芽胞桿菌對(duì)線蟲(chóng)的侵染不僅僅是實(shí)驗(yàn)室條件下觀察到的一種現(xiàn)象,也是自然界中所客觀存在的,Niu等還開(kāi)展了自然條件下的土壤試驗(yàn)。結(jié)果顯示,在自然土壤中,致病細(xì)菌B16同樣具有對(duì)線蟲(chóng)的吸引、固定和殺死能力,且其毒性蛋白酶在土壤中侵染線蟲(chóng)的方式也與實(shí)驗(yàn)室觀察到的一致。3真菌毒殺活性的研究進(jìn)展從天然資源中尋找和發(fā)現(xiàn)活性殺線蟲(chóng)化合物,是研發(fā)環(huán)境友好型生物殺線蟲(chóng)劑的重要途徑,也是利用生物資源,尋找先導(dǎo)化合物的重要途徑和國(guó)際研究的熱點(diǎn)。到目前為止,從微生物和植物中分離得到殺線蟲(chóng)活性代謝產(chǎn)物200余個(gè),這些活性代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型多樣,包括萜類、大環(huán)內(nèi)酯類、生物堿類、肽類、雜環(huán)類、簡(jiǎn)單芳香類、脂肪酸類、醌類、炔類、甾醇類、木脂素類、神經(jīng)酰胺類、preussomerin類和哌嗪類等。1981年,Hayashi等從乳白耙齒菌中分離得到一個(gè)二氧烷基化氫醌,對(duì)稻稈尖線蟲(chóng)的ED50為25mg·L-1。Zuckerman等報(bào)道一株黑曲霉在實(shí)驗(yàn)室、溫室以及田間試驗(yàn)中對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)表現(xiàn)出較好的毒殺活性,經(jīng)鑒定該菌培養(yǎng)液中含有檸檬酸、草酸等。Stemer等和Mayer等從奧爾類臍菇的發(fā)酵液中分離得到一個(gè)具較好商業(yè)價(jià)值的次級(jí)代謝物環(huán)十二縮肽omphalotinA,對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的活性高于目前廣泛使用的阿維菌素,但遺憾的是收率太低而無(wú)法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。近幾年,產(chǎn)毒真菌殺線蟲(chóng)活性的研究進(jìn)展很快,取得了一些可喜的成績(jī)。云南大學(xué)從1999年起先后評(píng)估了上千株擔(dān)子菌、半知菌以及子囊菌對(duì)線蟲(chóng)的毒殺活性,并報(bào)道了分離自粘帚霉屬Gliocladium的6個(gè)新的輪枝孢菌素,分別是gliocladineA、B、C、D、E以及glioclatine;分離自木霉屬Trichoderma的trichodermin、15-deacetylcalonectrin和3個(gè)新的倍半萜類化合物;分離自鬼傘屬Coprinus的含氧的雜環(huán)化合物5-methylfuran-3-carboxylicacid和5-hydroxy-3,5-dimethylfuran-2(5H)-one等10多個(gè)屬30多種真菌所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)有毒殺作用。此外還在食線蟲(chóng)真菌發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了stereumane類型的倍半萜、十三元大環(huán)內(nèi)酯、法尼基環(huán)己醇o(jì)ligosporon類、和降金輪霉素aurovertin類等不同類型的結(jié)構(gòu)骨架新穎的活性化合物。在水生真菌中發(fā)現(xiàn)了具有殺線蟲(chóng)和抗菌活性的的木脂類、萘醌類、酮類、大環(huán)內(nèi)酯等新化合物。2010年,從極端環(huán)境嗜熱真菌Talaromycesthermophilus中分離、篩選到6個(gè)新骨架大環(huán)內(nèi)酯化合物,包括化合物talathermophilinsA和B。另外在該菌中發(fā)現(xiàn)的化合物thermolides對(duì)病原線蟲(chóng)的致死率與目前國(guó)際上最好的殺線蟲(chóng)生物農(nóng)藥阿維菌素相當(dāng),且結(jié)構(gòu)式顯著小于阿維菌素,更利于人工合成。雖然目前已經(jīng)從微生物和植物資源中已發(fā)現(xiàn)了一批結(jié)構(gòu)多樣的天然殺線蟲(chóng)小分子化合物,并開(kāi)展了部份代謝調(diào)控和作用機(jī)制研究。但是,與豐富的生物資源和綠色環(huán)保市場(chǎng)需求相比,還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。深入挖掘新類型、新機(jī)制、高效安全的天然殺線活性化合物具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。4大豆胞囊線蟲(chóng)用微生物制劑在國(guó)外,Linford和Yap等于1939年首次嘗試著將5種捕食線蟲(chóng)真菌作為制劑施入土壤中防治線蟲(chóng),由此揭開(kāi)了用生防制劑防治線蟲(chóng)的序幕。后來(lái)的研究實(shí)驗(yàn)逐漸從盆栽、小區(qū)實(shí)驗(yàn)拓展到田間應(yīng)用,并且進(jìn)行了系統(tǒng)而又卓有成效的工作。Cayrol等對(duì)定殖于大豆胞囊線蟲(chóng)的真菌報(bào)道了15個(gè)屬,并成功地使用淡紫擬青霉防治大豆胞囊線蟲(chóng),防治效果高達(dá)60%,使大豆增產(chǎn)10%以上。張克勤等應(yīng)用厚垣普可尼亞菌PochoniachamydosporiumZK7在云南省大田推廣應(yīng)用8萬(wàn)多畝防治煙草根結(jié)線蟲(chóng),防治效果達(dá)50%~60%。目前,該制劑已經(jīng)獲得了國(guó)內(nèi)第一個(gè)微生物殺線蟲(chóng)劑的專利授權(quán)(中國(guó)農(nóng)藥登記號(hào)LS2001154)。這些產(chǎn)品或正在研發(fā)中的產(chǎn)品對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的生防起到了很大的推動(dòng)作用,隨著更多更有價(jià)值的食線蟲(chóng)真菌新物種和