2型糖尿病地鼠模型的建立及穩(wěn)定性研究

2型糖尿病地鼠模型的建立及穩(wěn)定性研究

2型糖尿病的病因和機制尚不清楚，治療效果也不完整。因此，建立符合2型糖尿病發(fā)病特點的簡單組合數(shù)據(jù)模型對研究該病的發(fā)病機制和治療具有重要意義。目前普遍應用高能量高脂飲食和小劑量STZ制備2型糖尿病動物模型,但高能量高脂飲食飼喂方式和時間、STZ的給藥方式和劑量,穩(wěn)定成模時間,模型的穩(wěn)定性尚無權威性報道。我們結(jié)合以往的研究建立制備2型糖尿病中國地鼠模型的方法并系統(tǒng)觀察糖尿病地鼠模型的成模率、穩(wěn)定成模時間和模型的穩(wěn)定性及影響因素。1材料和方法1.1實驗動物與試劑清潔級中國地鼠60只,血糖(4.7±0.47)mmol/L,雌雄各半,約26周齡,體重(127±20.16)g,購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所,許可證號:SCXK(川)2004-16。單籠飼養(yǎng),自由攝食攝水。誘導劑STZ購自Sigma公司。應用穩(wěn)豪血糖儀監(jiān)測血糖。鼠胰島素ELISA試劑盒購自Linco公司。血清甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFAs)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、總膽固醇(TC)試劑盒購自Randox公司。應用日立8060全自動生化分析儀進行檢測。1.2脂飲食階段a、c組參照中外學者的造模方法并加以改良?，F(xiàn)簡述如下:健康地鼠60只,雌雄各半,將雄、雌性地鼠隨機分為兩類,共4組:A、B組為雄性鼠和C、D組為雌性鼠,每組15只。A、C組為實驗組,飼以高能量高脂飲食(飼料中含10%的豬油、10%的蛋黃粉、1%的膽固醇和0.02%的膽酸)。B、D組為對照組,飼以普通飼料。在第30天末,實驗組(A、C組)禁食12h后,按40mg/kg(將STZ用0.1mmol/L,pH4.2的無菌檸檬酸緩沖液配制成1%STZ溶液,0.2mm微孔過濾滅菌)的劑量間隔2d兩次腹腔注射STZ,注射后繼續(xù)禁食12h。對照組(B、D組):腹腔注射0.1mmol/L,pH4.2的無菌檸檬酸緩沖液(注射方式和劑量同A、C組)。注射完畢后,實驗組(A、C組)繼續(xù)飼以高能量高脂飼料,對照組(B、D組)繼續(xù)飼以普通飼料。1.3觀察指標1.3.1大鼠胰島素抵抗的評價STZ給藥前,測定實驗組和對照組地鼠的體重(BW)、空腹血糖(FBG)、空腹血胰島素(FNS)及血脂水平,以評價飲食誘導胰島素抵抗的狀況。1.3.2血糖和血脂敏感指標注射STZ后12h、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d、18d監(jiān)測空腹血糖和餐后血糖,此后,每周測一次空腹血糖、餐后血糖、體重、血脂、血清胰島素,觀察至第14周共22次。注射STZ3周后,同時滿足下列三項標準(①胰島素敏感指數(shù)ISI=[1/(空腹血糖值×空腹血清胰島素值)]降低;②葡萄糖耐量實驗曲線下面積≥26;③72h后空腹血糖≥7.8mmol/L)為2型糖尿病模型地鼠,并判斷成模率。1.3.3眼內(nèi)瞳取血糖檢測地鼠禁食12h后,給予葡萄糖2g/kg灌胃,然后在設定的時間點(0、0.5、1、2h)眼內(nèi)眥取血測血糖,STZ給藥第3周和試驗最后一天各檢測一次。糖耐量曲線下面積=0.5×空腹血糖+30min血糖+1.5×60min血糖+120min血糖。1.3.4病理樣品的采集和生產(chǎn)第14周實驗結(jié)束時分離胰腺,10%中性甲醛溶液固定,逐級脫水,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡觀察。1.4監(jiān)測點血糖、血脂及胰島素值的測定數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,應用軟件SPSS13.0,對各監(jiān)測點血糖、血脂及胰島素值等進行實驗組和對照組的t檢驗,P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1各組大鼠血漿tg、tc、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ldl-c、ldl-c、ldl-c、fa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl實驗組和對照組相比體重增加,但無顯著性差異。實驗組地鼠血漿TG、TC、FFA、LDL-c明顯增加,空腹血糖雖有所增高但無顯著性差異。實驗組地鼠空腹胰島素明顯增加(表1)。2.2血糖、血糖和糖耐量實驗組地鼠注射STZ后12h起空腹血糖開始升高,同時出現(xiàn)多飲、多尿等癥狀。A、C兩組各有2只死亡和2只模型未成立,符合成模標準的地鼠數(shù)量為22只,成模率為73.3%。實驗過程中實驗組地鼠癥狀逐漸明顯,但體重無明顯變化。實驗組地鼠血漿TG、TC、FFA、LDL-c明顯增高,而胰島素雖有所增高但無顯著性差異(表2)。自注射STZ48h起,至其后各監(jiān)測點實驗組和對照組的空腹血糖均有明顯差異。實驗組血糖48h后呈升高狀態(tài),C組自第6天起至第14周期間各檢測點之間血糖無差異;A組血糖有波動,自第14天起至第14周期間各檢測點之間血糖無差異(表3,圖1),血糖達到穩(wěn)定。實驗組糖耐量實驗各點血糖值、糖耐量曲線下面積顯著高于對照組,而ISI顯著低于對照組(表4)。胰腺組織形態(tài)觀察(第14周時):實驗組胰島及島內(nèi)細胞數(shù)減少,可見胰島內(nèi)細胞空泡變性,但未見淋巴細胞浸潤(圖2,3見封Ⅲ)。3型糖尿病模型糖尿病是嚴重威脅人類健康的世界性疾病,其中大部分為2型糖尿病,因此2型糖尿病動物模型的研制對研究2型糖尿病的發(fā)病機理及治療具有重要意義。目前常用注射STZ的方法制備2型糖尿病動物模型。結(jié)合相關文獻,我們采用高能量高脂飲食誘發(fā)地鼠胰島素抵抗,在此基礎上通過小劑量STZ腹腔注射形成高血糖狀態(tài)的方法制造2型糖尿病地鼠模型,同時繼續(xù)喂以高能量高脂飲食維持2型糖尿病狀態(tài)。結(jié)果顯示,此造模方法成模穩(wěn)定,成模率較高,死亡率低。實驗過程中,實驗組地鼠經(jīng)高能量高脂飲食喂養(yǎng)1個月后體重有所增加,血TG、FFAs、TC、LDL-C明顯增高,血漿胰島素明顯增加,表明高能量高脂飲食誘導出了胰島素抵抗。在注射STZ后逐漸出現(xiàn)多飲、多食及多尿等糖尿病表現(xiàn)。模型鼠血胰島素有所升高,胰島素敏感指數(shù)降低,血糖升高,糖耐量實驗異常。同時體內(nèi)脂代謝異常,血清TG、TC、FFAs和LDL-C明顯升高,本模型制備過程模擬了2型糖尿病的發(fā)病過程,具有大部分2型糖尿病的臨床特點。同時發(fā)現(xiàn),制備的2型糖尿病模型鼠中,血糖穩(wěn)定性與性別有關,雌鼠血糖于