sz誘導(dǎo)大鼠型糖尿病模型的穩(wěn)定性研究

sz誘導(dǎo)大鼠型糖尿病模型的穩(wěn)定性研究

目前，已經(jīng)報(bào)告了使用鏈香素（stz）建立糖尿病動(dòng)物模型的研究。這些動(dòng)物通常用于降低血糖藥物的選擇，并選擇維持在較高的時(shí)期作為觀察窗口，這有助于評(píng)估抗高血壓藥物的愈合效果。然而，關(guān)于stz注射后是否需要多長(zhǎng)時(shí)間的糖達(dá)到較高水平并保持較高的報(bào)告略有不同。對(duì)未成模動(dòng)物很少有人研究,其胰島有無破壞,糖耐量有無異常,以后血糖是否會(huì)升高,是否可用于建立糖尿病模型等,都還缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)采用空腹血糖測(cè)量、腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)以及形態(tài)學(xué)觀察等方法對(duì)糖尿病動(dòng)物模型穩(wěn)定性進(jìn)行了研究和探討。1材料和方法1.1佐菌素、糖酸酯和甲基樹脂雄性SD大鼠,10～12周齡,體重280～320g,由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。鏈脲佐菌素,瑞士ALEXIS公司;ONETOUCHSureStep微血糖測(cè)量?jī)x,中國(guó)強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司;穩(wěn)步醫(yī)院用血糖試紙,美國(guó)LifeScanInc;羥乙基甲基丙烯酸樹脂,德國(guó)HeraeusKulzer公司;OlympusBX50型生物顯微鏡,日本Olympus公司。1.2實(shí)驗(yàn)分組、材料和實(shí)驗(yàn)方法51只雄性SD大鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組15只,實(shí)驗(yàn)組36只。所有動(dòng)物均喂養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,室內(nèi)通風(fēng)良好,相對(duì)濕度為45%～65%,室溫保持在18～26℃。分籠喂養(yǎng),每籠5只,自由攝取水和大鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將STZ臨用前以0.1mol/L(pH4.2)的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液溶解。在不禁食的條件下,實(shí)驗(yàn)組按60mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射STZ;對(duì)照組一次性腹腔內(nèi)注射等量的緩沖液。1.3血糖值設(shè)定的意義在注射STZ或緩沖液后的第7、14、28、42、56和84d給動(dòng)物禁食、禁水7小時(shí)后測(cè)空腹血糖(剪尾取血,用微血糖測(cè)量?jī)x及配套的血糖試紙,最大血糖值為27.8mmol/L,更高的血糖值儀器顯示為H,這種情況血糖值被當(dāng)作為27.8mmol/L);然后從對(duì)照組輪流抽取4～5只動(dòng)物,從實(shí)驗(yàn)組抽取所有空腹血糖<10mmol/L的動(dòng)物進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT),即腹腔內(nèi)注射葡萄糖(濃度50%,注射量2g/kg),30、60和120min后測(cè)量血糖,如果葡萄糖注射后120min血糖值大于相應(yīng)對(duì)照組的所有動(dòng)物的該值,且≥10mmol/L,IPGTT則為異常。1.4pas及蘇蘇葉精染色在注射STZ或緩沖液后的第84d,處死大鼠,取出胰腺置Bouin液內(nèi)浸潤(rùn)固定,70%乙醇脫水后,行組織塊等距隨機(jī)抽樣(每個(gè)胰腺共抽選8個(gè)組織塊);將其中每2個(gè)組織塊放入一個(gè)包埋盒中用樹脂包埋;從每個(gè)包埋塊間隔切取10μm厚的切片,共3張;選取第1張和第3張切片進(jìn)行PAS及蘇木精染色。每個(gè)胰腺共得8張切片。1.5胰島的形態(tài)特征觀察使用OlympusBX50型生物顯微鏡,在×10和×20物鏡(數(shù)值孔徑分別為0.30和0.50)和×10目鏡下全面仔細(xì)觀察整張切片,記錄胰島的形態(tài)特征以及胰島內(nèi)細(xì)胞核的多少、形態(tài)、大小和染色的深淺情況。1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SigmaStat1.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,兩組之間的均值比較采用t檢驗(yàn),個(gè)別數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2結(jié)果2.1模型模擬成功率實(shí)驗(yàn)組注射STZ后第7天血糖達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)(>11.1mmol/L)的大鼠(成模組)有19只,血糖未達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)的大鼠有10只,死亡7只,模型成功率為53%。2.2一般條件下的情況隨著病程進(jìn)展,成模組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食、毛失去光澤、脫毛、消瘦、活動(dòng)減少和傷口易感染等表現(xiàn),部分出現(xiàn)白內(nèi)障。2.3未成模大鼠iprtt正常對(duì)照組、成模組(含各天死亡動(dòng)物)的空腹血糖結(jié)果見表1,對(duì)照組IPGTT均正常。未成模大鼠中,3只IPGTT異常,并分別在第14、28和第42d血糖達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn);5只IPGTT異常,各天血糖正常;2只IPGTT各天血糖均正常。2.4成模組胰島細(xì)胞形態(tài)和大小不確定量對(duì)照組胰島多為圓形或橢圓形的細(xì)胞團(tuán),界限清楚,數(shù)量較多;胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較多,見圖1。成模組胰島數(shù)量明顯減少,形態(tài)不規(guī)則;胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少,核的形態(tài)和大小不均一,部分胰島內(nèi)細(xì)胞核較密集,染色較深,見圖2、3。未成模大鼠有的胰島似對(duì)照組胰島的形態(tài)結(jié)構(gòu),有的胰島似成模組胰島的形態(tài)結(jié)構(gòu)。3糖尿病模型成功與否的判斷本實(shí)驗(yàn)表明,在不禁食的條件下,給雄性SD大鼠按60mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射STZ后,第7天血糖達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)的大鼠(成模組)有19只,死亡7只,模型成功率為53%,不及一些文獻(xiàn)報(bào)道的可達(dá)80%～90%。我們推測(cè)與給藥時(shí)間(空腹或非空腹時(shí))、途徑(靜脈或腹腔內(nèi)注射)以及動(dòng)物種屬、大小、飼養(yǎng)條件等有關(guān)。部分大鼠在注射后1周內(nèi)出現(xiàn)突然死亡,此時(shí)為糖尿病模型大鼠最易死亡的一個(gè)時(shí)期,推測(cè)是由于大鼠的體質(zhì)不盡相同,而STZ具有一定的毒性和副作用,導(dǎo)致大鼠死亡。因此,這段時(shí)間內(nèi)應(yīng)特別注意大鼠的飼養(yǎng),加強(qiáng)各種保護(hù)措施,盡量減少大鼠的死亡率。目前一般認(rèn)為大鼠腹腔注射STZ第3d后血糖達(dá)到規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)即可認(rèn)為造模成功。本實(shí)驗(yàn)在注射STZ后第7、14、28、42、56和84d檢測(cè)了空腹血糖,來考察模型的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)成模組血糖始終在高血糖水平上波動(dòng),且未見轉(zhuǎn)復(fù),這與于德民等研究的報(bào)道一致,但未發(fā)現(xiàn)其血糖隨病程的延長(zhǎng)而有所提高,或有自發(fā)性緩解的現(xiàn)象;同時(shí)大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦及白內(nèi)障等表現(xiàn),符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn);胰腺切片形態(tài)學(xué)觀察顯示,胰島數(shù)量明顯減少,形態(tài)不規(guī)則,胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少等,進(jìn)一步證實(shí)了模型的穩(wěn)定性良好。本實(shí)驗(yàn)提示,STZ注射后7～84d是觀察降糖藥物療效的最適宜時(shí)段。判斷造模成功的指標(biāo),研究中多采用測(cè)外周血糖、尿糖、血清胰島素水平和C肽值等。國(guó)外有學(xué)者采用口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)作為判斷與比較糖尿病情況的指標(biāo)之一,OGTT是在當(dāng)血糖升高的程度未達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),不能確診糖尿病而進(jìn)行的一種進(jìn)一步確診糖尿病的檢驗(yàn)措施。但目前在用STZ誘發(fā)大鼠糖尿病模型的研究中,只用空腹血糖值作為判斷大鼠成模的指標(biāo),較少使用OGTT。本實(shí)驗(yàn)給所有空腹血糖<10mmol/L的動(dòng)物進(jìn)行了腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT),發(fā)現(xiàn)在注射STZ后第7天血糖未達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)的大鼠(10只)中,3只IPGTT異常,并分別在第14、28和第42d血糖達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn),5只IPGTT異常,但各天血糖正常,2只IPGTT各天血糖均正常;未成模大鼠中有的胰島似對(duì)照組胰島的形態(tài)結(jié)構(gòu),有的胰島似成模組胰島的形態(tài)結(jié)構(gòu),這與黃波等報(bào)道的未成模動(dòng)物胰島的形態(tài)結(jié)構(gòu)類似于正常對(duì)照組不完全相同。以上說明未成模大鼠的胰島也受到不同程度的破壞,雖然開始未達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn),但大部分大鼠(8只)已導(dǎo)致糖耐量減退,以后小部分大鼠(3只)血糖達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn),且未見轉(zhuǎn)復(fù),故我們認(rèn)為,這部分大鼠也可作為I型糖尿病模型。有學(xué)者研究表明,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中空腹血糖值并不能很準(zhǔn)確地反映出動(dòng)物成模的真實(shí)情況,有的大鼠其空腹血糖值雖正常,但OGTT結(jié)果顯示其糖