2型糖尿病大鼠模型制備的研究進(jìn)展

2型糖尿病大鼠模型制備的研究進(jìn)展

2型糖尿病（t2d）是一種復(fù)雜的多基因遺傳疾病。目前，假設(shè)它有兩個(gè)機(jī)制：胰島素抵抗和胰島細(xì)胞功能障礙。環(huán)境因素如高熱量飲食所致的超重及肥胖在胰島素抵抗的發(fā)生中起到至關(guān)重要的作用。目前還沒有模型可以完全模擬2型糖尿病的病理生理機(jī)制,如國外常用的ob/ob小鼠、肥胖Zucker大鼠、自發(fā)性MGK-Wistar大鼠及OLETF大鼠,其遺傳因素占主導(dǎo)作用,不能模擬環(huán)境因素如飲食、肥胖在2型糖尿病發(fā)病中的作用。我國常用的傳統(tǒng)高熱量飲食加鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)造模被認(rèn)為具有外周胰島素抵抗和胰島細(xì)胞受損雙重特點(diǎn),在一定程度上符合人類2型糖尿病的發(fā)病過程,本文主要?dú)w納STZ配合高熱量飲食誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的影響因素。1大鼠的水系、性別、體重和年齡1.1wolbachia對(duì)大鼠stz的敏感性大鼠是建立糖尿病模型最常用的動(dòng)物。目前STZ誘導(dǎo)大鼠DM模型被認(rèn)為是最常用的有效而經(jīng)濟(jì)的方法。國內(nèi)常用的是SD大鼠或Wistar大鼠。相比較而言,許多學(xué)者主張用SD大鼠造模,因?yàn)镾D大鼠的抵抗力強(qiáng)于Wistar大鼠,農(nóng)慧等曾比較過用相同劑量的STZ造模,Wistar大鼠的死亡率可以達(dá)到50%以上。陳楓等對(duì)大鼠品系進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示W(wǎng)istar大鼠較SD大鼠更易成模,且死亡率低,可以推斷Wistar大鼠對(duì)STZ的敏感性高于SD大鼠。故選用合適的動(dòng)物品系可以提高成模率,降低死亡率,降低實(shí)驗(yàn)成本。1.2給藥穩(wěn)定性STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型有性別差異,國內(nèi)亦有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雄性SD大鼠為最佳試驗(yàn)動(dòng)物。雌性大鼠成模率低且不穩(wěn)定,可能是在同等給藥劑量、同等給藥途徑的條件下,雄性對(duì)鏈脲霉素更為敏感。另外有研究提示與睪酮對(duì)STZ誘導(dǎo)的早期凋亡損傷具有保護(hù)作用有關(guān),性別也影響血糖的穩(wěn)定性,雄性大鼠腹腔注射STZ后14d血糖穩(wěn)定,而雌鼠4周后血糖才穩(wěn)定,而且成年后雌激素對(duì)糖脂代謝會(huì)產(chǎn)生一定的影響,可見選擇雄鼠造模對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)干擾更少。1.3大鼠死亡率、成模率體重對(duì)成模率也有影響。張新蘭等從實(shí)驗(yàn)中得出結(jié)論:體重在220-260g大鼠成模率高且死亡率低。體重低于200g成模率高但死亡率也較高;體重高于260g大鼠死亡率、成模率均較低。此結(jié)論亦在許多實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。1.4其他大劑量注射STZ誘導(dǎo)大鼠DM方法各異,主要有成年或幼年多次小劑量、成年一次性小劑量注射、成年一次性大劑量注射;還有的采用在乳鼠時(shí)期大劑量注射STZ,成年后小劑量注射的方法。但是劉氏等認(rèn)為鼠齡大的大鼠體內(nèi)進(jìn)入藥物的總量比鼠齡小的多,且代謝活動(dòng)減慢,對(duì)STZ的滅活作用減弱,藥物對(duì)胰島β細(xì)胞的破壞更為嚴(yán)重。因此多選用成年一次性小劑量注射,使模型更接近T2DM。2tm發(fā)病過程STZ注射通過直接破壞胰島β細(xì)胞,造模成功率較高,但與T2DM發(fā)病過程不完全相符。高熱量飲食誘導(dǎo)配合小劑量STZ注射,可以使模型具有與T2DM類似的生化代謝及臨床特點(diǎn),因此,該模型可作為研究T2DM的相對(duì)理想的動(dòng)物平臺(tái)。2.1對(duì)大鼠ir的影響目前關(guān)于單純IR的動(dòng)物模型的研究較少,國外這類模型是SD或Wistar大鼠腹腔注射低劑量地塞米松(2μg/d)及喂飼蔗糖的飼料,引起大鼠發(fā)生IR,但其實(shí)驗(yàn)周期較長,并且單一因素引起的病理狀態(tài)與正常發(fā)病過程還有區(qū)別,故應(yīng)用較少。我國主要是高脂高糖飼料誘導(dǎo)IR。2.1.1高脂高糖飼料配方綜合征發(fā)病的重要因素。研究已證實(shí)當(dāng)胰島細(xì)胞功能逐漸下降不能對(duì)IR完全代償,便出現(xiàn)T2DM。2.1.2高脂高糖飼料IR是區(qū)分1型和2型糖尿病動(dòng)物模型的關(guān)鍵,長期高糖高脂飲食可成功誘導(dǎo)胰島素抵抗。高脂高糖飼料配方常如下:(1)高脂高糖飼料:動(dòng)物脂肪15%、蔗糖20%、膽固醇5%、普通飼料60%。(2)高糖高脂飼料由10%豬油,20%蔗糖,2.5%膽固醇,1.0%膽酸鹽,66.5%常規(guī)飼料配制。仔細(xì)閱讀大量文獻(xiàn)資料可見高脂高糖飼料的配方:普通飼料60-70%,動(dòng)物脂肪10-15%,蔗糖15-20%,膽固醇3-5%,其他5-10%。2.2高脂養(yǎng)殖藥血藥濃度設(shè)計(jì)若STZ劑量偏大,大鼠胰島β細(xì)胞破壞過多,則類似T1DM,且死亡率高。高脂飲食誘導(dǎo)時(shí)間延長,大鼠肥胖和IR更明顯,加重胰島分泌功能的負(fù)擔(dān),使所需STZ劑量減少。故研究高熱量喂養(yǎng)時(shí)間、確定STZ劑量對(duì)動(dòng)物模型的影響是必要的。為誘導(dǎo)出IR,一般采用高脂飲食飼養(yǎng)1個(gè)月后加一次小劑量STZ注射。亦有研究發(fā)現(xiàn),高熱量喂養(yǎng)6周后腹腔注射STZ30mgPkg,成模率為75%。何清華等按照不同高脂喂養(yǎng)時(shí)間及STZ劑量設(shè)計(jì)了3種不同方法,研究表明,4周齡雄性SD大鼠,高脂喂養(yǎng)8周后腹腔注射STZ30mgPkg,成模率最高,無動(dòng)物死亡,更適合于2型糖尿病的相關(guān)研究。鼠齡較小(8周齡)時(shí),大鼠器官處于生長期,組織容易修復(fù),且此階段藥物內(nèi)臟比值偏低,故造成成模率低。當(dāng)鼠齡較大(14周及16周齡時(shí)),內(nèi)臟增長緩滯,而體重仍持續(xù)快速增長,致使單位重量臟器負(fù)荷STZ絕對(duì)量增加,對(duì)胰腺等內(nèi)臟器官破壞加劇,因此導(dǎo)致大鼠死亡率升高。因此,控制高熱量誘導(dǎo)時(shí)間也是造模成功的一個(gè)必要因素。2.3糖脂代謝及胰島素敏感性高熱量飲食導(dǎo)致體內(nèi)糖脂代謝紊亂,通過糖脂肪酸循環(huán)、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)途徑抑制糖儲(chǔ)存,降低胰島素敏感性,而導(dǎo)致IR的發(fā)生。為解決大鼠攝取高脂飼料所致食欲下降,而造成脂肪攝入量不均衡的問題,普遍認(rèn)為灌胃脂肪乳等灌胃的方式可以均衡控制大鼠脂肪攝入量。3riheim佐內(nèi)素溶劑、注射量、注射頻率和注射方法3.1溶劑及其酸度對(duì)模型的影響宋立江等發(fā)現(xiàn):在pH4.5檸檬酸PBS、pH5.5Hanks、pH7.0Hanks、pH7.0生理鹽水4種溶劑中,溶解鏈脲佐菌素腹腔注射,觀察溶劑及其酸堿度對(duì)模型的影響,結(jié)果pH4.5檸檬酸PBS可以作為理想的溶劑。3.2胞的誘導(dǎo)表達(dá)一次性大劑量注射STZ直接損傷胰島β細(xì)胞,所以常認(rèn)為誘導(dǎo)出的是T1DM。多次注射小劑量STZ因?yàn)榧せ蠲庖呦到y(tǒng),誘導(dǎo)胰島的免疫反應(yīng),產(chǎn)生更接近于T2DM的模型。3.2.1tm器官病理變化型普遍采用50-60mg/kg,成模率高,死亡率亦高,且常在高血糖25-35周后才出現(xiàn)明顯的T2DM器官病理變化。目前普遍認(rèn)為小劑量(40mg/kg以下)STZ引發(fā)胰島β細(xì)胞凋亡,大劑量(50mg/kg以上)則引起胰島β細(xì)胞壞死。3.2.2劑量注射或高stz多次小劑量注射異,主要多次小劑量(25mg/kg左右)注射、一次性大劑量(50mg/kg以上)注射或福氏完全佐劑加STZ多次小劑量注射等。但是目前多數(shù)研究者認(rèn)為多次小劑量造模更類似于T2DM,龐燕等認(rèn)為:2次給藥法較1次給藥法成模率高。3.3尾靜脈注射成模率高STZ注射的不同途徑均可使大鼠發(fā)生糖尿病,但國內(nèi)外均有實(shí)驗(yàn)表明尾靜脈注射的成功率高于腹腔注射,其可能與靜脈注射藥物吸收更直接有關(guān)。近年來有實(shí)驗(yàn)采用的腹腔注射法,其成模率可以達(dá)到95%。但是何清華等認(rèn)為尾靜脈注射比腹腔注射所需劑量小。相較而言,腹腔注射法易于操作,尾靜脈注射技術(shù)大難度。靜脈注射時(shí)要注意注射速度,以免速度快而致心衰,還要避免劑量過大致大鼠藥物性中毒而亡。國內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是采用腹腔注射法,腹腔注射時(shí)抓住大鼠頭朝下,腹腔朝上,使內(nèi)臟移向上腹,避免注射入其他臟器內(nèi)。諸多細(xì)節(jié)都影響大鼠成模率,控制好條件尤其重要。4大鼠飼料環(huán)境4.1不同飼養(yǎng)方位動(dòng)物的光照對(duì)dm模型的影響不同的光照可影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理活動(dòng)。因此光照是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)重要因素。不同光照可以促進(jìn)或抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)分泌激素的分泌。我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室多采用頂部照明,因此不同飼養(yǎng)方位的動(dòng)物吸收光照的均勻性并不一致。周衛(wèi)民等認(rèn)為:光照較強(qiáng)處,成模率較低,反之則較高,但光照對(duì)成模后模型的穩(wěn)定性影響不大,提示光照也是影響DM模型成模率的一個(gè)重要因素。但龐燕等認(rèn)為日照時(shí)間短,強(qiáng)度弱明顯降低成模率,增加死亡率。因此光照影響成模率高低是否與大鼠由于不同的光照而影響飲食量有關(guān),則仍有待進(jìn)一步的研究。4.2動(dòng)物飼養(yǎng)密度大鼠的等級(jí)及飼養(yǎng)環(huán)境相當(dāng)重要。因?yàn)槌赡：蟠笫蟮拿庖吡ο陆?并發(fā)癥會(huì)逐漸出現(xiàn)。以前多用普通級(jí)SD大鼠在普通級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)造模,大鼠的死亡率超過50%。農(nóng)慧等采用SPF級(jí)大鼠,死亡率僅為21.7%。飼養(yǎng)室內(nèi)應(yīng)保持通風(fēng)良好,每天至少通風(fēng)2次,上下午各通風(fēng)2h,相對(duì)濕度為40%-70%,室溫18-25℃,動(dòng)物飼養(yǎng)密度不宜過大,大鼠4-5只/籠飼養(yǎng)比較好,否則大鼠極易患上呼吸道感染或肺內(nèi)感染。另外應(yīng)采用有底盤的鼠盒,把墊料和大鼠分離開,每日更換墊料尤其是造模成功后大鼠尿量明顯增加,故每天應(yīng)換2-3次墊料,以保持鼠籠清潔干爽,可以減少大鼠的死亡率。5stz的使用效果為保證科研工作順利進(jìn)行。許多飼養(yǎng)糖尿病大鼠的專家學(xué)者提出幾點(diǎn)需要注意的方面:(1)造模前大鼠應(yīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,體重維持在200-220g之間,使之保持良好的營養(yǎng)狀態(tài)及較強(qiáng)的抵抗力。(2)STZ必須低溫保存,現(xiàn)配現(xiàn)用。配好的檸檬酸緩沖溶液和STZ溶液應(yīng)避光,低溫放置,10min內(nèi)用完。(3)大量文獻(xiàn)報(bào)道注射STZ前大鼠空腹12h以上,可提高成模率,注射STZ后,應(yīng)觀察2h左右,給予充足飲水及食物。(4)造模后大鼠需頻繁的測血糖,以往多采取眶靜脈或斷尾法取血對(duì)大鼠傷害大,且易合并感染,故建議采取尾靜脈采血法測量血糖,并且要特別注意采血部位的消毒,可以用碘伏每日2次消毒或涂以皮炎平軟膏,避免感染。STZβ綜上所述,STZ對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞具有高度選擇性毒性作用,可使之產(chǎn)生糖尿病,尤其是使之成為2型糖尿病,影響造模成功與否的因素較多,可以歸納為三大方面:(1)大鼠的選擇,(2)STZ的應(yīng)用,(3)大鼠的飼養(yǎng)。雄性大鼠的成模率高于雌性,成鼠較幼鼠更易