新教材2023年高中生物第3章基因工程第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具學(xué)案新人教版選擇性必修3

第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具新課程標(biāo)準(zhǔn)核心素養(yǎng)1．簡(jiǎn)述重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具及其作用。2．認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。3．進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定。1．科學(xué)思維——模擬重組DNA分子的操作過程，說出合成新DNA分子的基本原理。2．社會(huì)責(zé)任——關(guān)注基因工程的社會(huì)議題，參與討論基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展如何催生了基因工程。知識(shí)導(dǎo)圖必備知識(shí)·夯實(shí)雙基一、基因工程的概念1．操作場(chǎng)所：__生物體外__。2．操作技術(shù)：__轉(zhuǎn)基因__等技術(shù)。3．操作結(jié)果：賦予生物新的__遺傳特性__，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的__生物類型__和生物產(chǎn)品。4．操作水平：__DNA分子__水平。二、DNA重組技術(shù)的基本工具1．限制性內(nèi)切核酸酶(又稱限制酶)——“分子手術(shù)刀”(1)來源：主要來自__原核生物__。(2)功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定__核苷酸序列__，并使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的__磷酸二酯鍵__斷開。(3)結(jié)果：產(chǎn)生__黏性末端__或__平末端__。2．DNA連接酶——“分子縫合針”(1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的__磷酸二酯鍵__。(2)種類[填表]種類比較E．coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源__大腸桿菌____T4噬菌體__特點(diǎn)只能連接__黏性末端__既可以連接黏性末端，又可以連接__平末端__3．基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”(1)質(zhì)粒①質(zhì)粒的本質(zhì)：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，獨(dú)立于__真核細(xì)胞的細(xì)胞核__或__原核細(xì)胞擬核DNA__之外，并具有__自我復(fù)制__能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。②質(zhì)粒適于作基因運(yùn)載體的特點(diǎn)Ⅰ．質(zhì)粒分子上有一個(gè)至多個(gè)__限制酶切割__位點(diǎn)，供外源DNA片段插入其中。Ⅱ．?dāng)y帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，能在細(xì)胞中__進(jìn)行自我復(fù)制__，或__整合到受體DNA上__，隨__受體細(xì)胞DNA__同步復(fù)制。Ⅲ．人工改造的質(zhì)粒常帶有__標(biāo)記基因__，便于__重組DNA分子的篩選__。(2)噬菌體、動(dòng)植物病毒等。三、DNA的粗提取與鑒定1．實(shí)驗(yàn)原理(1)__DNA__不溶于酒精，__蛋白質(zhì)__溶于酒精。(2)DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于__2mol/L的NaCl__溶液。(3)在一定溫度下，DNA遇__二苯胺__試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。2．實(shí)驗(yàn)步驟(1)稱取30g洋蔥，切碎，加入10mL研磨液，充分研磨?！?2)漏斗中墊__紗布__，將研磨液過濾到燒杯中，__4__℃處理，取上清液。↓(3)在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的__酒精__溶液，靜置2～3min，用玻璃棒沿同一方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去水分?！?4)取兩支20ml的試管編號(hào)A、B，各加入2mol/L的__NaCl__溶液5mL，將絲狀物溶于B試管的NaCl溶液中。然后向兩支試管中各加入4mL的__二苯胺試劑__。混勻后，將試管置于__沸水__中加熱5min。↓(5)結(jié)果觀察：A試管__不變藍(lán)__，B試管__變藍(lán)色__。┃┃學(xué)霸記憶__■1．基因工程的基本原理是基因重組，外源DNA能在受體細(xì)胞表達(dá)的理論基礎(chǔ)是密碼子的通用性。2．DNA重組技術(shù)的基本工具有限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體。3．限制性內(nèi)切核酸酶可識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并在特定位點(diǎn)上切割。4．E．coliDNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端。5．質(zhì)粒作為基因工程的載體需具備的條件有：能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并自我復(fù)制；具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；具有標(biāo)記基因。6．在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有噬菌體、動(dòng)植物病毒等。7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。8．DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。9．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。┃┃活學(xué)巧練__■1．基因工程的原理是基因重組，不過在這里這種變異是定向的。(√)2．DNA聚合酶也可以用作DNA重組技術(shù)的工具。(×)3．限制酶在原來的原核細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞自身有害。(×)4．不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端相同。(√)5．DNA連接酶既能連接黏性末端，又能連接平末端。(×)6．載體的種類有質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等，其中動(dòng)植物病毒必須是DNA病毒。(√)思考：1．為什么限制酶主要從原核生物中分離純化而來？推測(cè)它在原核生物中的作用是什么？它會(huì)不會(huì)切割自己的DNA分子？提示：原核細(xì)胞容易受到外源DNA的入侵，原核細(xì)胞中的限制酶能夠切割入侵的外源DNA而保護(hù)自身。原核細(xì)胞中的限制酶不會(huì)切割自己的DNA分子，因?yàn)槊妇哂袑Ｒ恍曰蜃约旱腄NA分子已被修飾而不被識(shí)別。2．限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶的作用是否都體現(xiàn)了酶的專一性？提示：限制性內(nèi)切核酸酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，體現(xiàn)了酶的專一性。E．coliDNA連接酶能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來，對(duì)末端的堿基序列沒有要求；T4DNA連接酶既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA分子的平末端，都對(duì)末端的堿基序列沒有要求，因此DNA連接酶的作用沒有體現(xiàn)酶的專一性。3．細(xì)胞膜上的載體與基因工程中的載體有什么不同？提示：(1)化學(xué)本質(zhì)不同：細(xì)胞膜上的載體化學(xué)成分是蛋白質(zhì)；基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)、λ噬菌體的衍生物，也可能是生物，如動(dòng)植物病毒等。(2)功能不同：細(xì)胞膜上的載體功能是協(xié)助細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞；基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”，把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。4．如何檢測(cè)(重組)質(zhì)粒是否導(dǎo)入受體細(xì)胞？提示：含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對(duì)該抗生素產(chǎn)生抗性，因此培養(yǎng)受體細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入該種抗生素即可篩選。在培養(yǎng)基上，被抗生素殺死的是沒有抗性的受體細(xì)胞，沒被殺死的具有抗性的受體細(xì)胞得以篩選。課內(nèi)探究·名師點(diǎn)睛知識(shí)點(diǎn)限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)—“分子手術(shù)刀”1．作用特點(diǎn)①切割外源DNA，對(duì)自身的DNA不起作用，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。②專一性：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。2．作用結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端。①黏性末端：錯(cuò)位切，在識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開，產(chǎn)生的是黏性末端，如下圖。②平末端：平切，沿著識(shí)別序列的中心軸線切開，產(chǎn)生的是平末端，如下圖。3．限制酶的識(shí)別序列和切割末端的判斷(1)識(shí)別序列的特點(diǎn)：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無論是奇數(shù)個(gè)堿基還是偶數(shù)個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，如右圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。如以中心線為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對(duì)稱；eq\b\lc\(\a\vs4\al\co1(CCAGG,GGTCC))以eq\b\lc\(\a\vs4\al\co1(A,T))為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對(duì)稱。(2)同一種限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定來自同一種限制酶的切割，但同樣能相互連接。┃┃典例剖析__■典例1下列有關(guān)基因工程中限制酶的描述，錯(cuò)誤的是(A)A．一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核糖核苷酸序列B．限制酶的活性受溫度、pH的影響，總有一個(gè)最合適的條件C．限制酶能破壞相鄰脫氧核苷酸之間的化學(xué)鍵D．限制酶不只存在于原核生物中，其合成場(chǎng)所是核糖體解析：限制酶只能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的脫氧核苷酸序列，不能識(shí)別RNA分子的核糖核苷酸序列，A項(xiàng)錯(cuò)誤；同其他的酶一樣，限制酶同樣受溫度和pH的影響，而且具有發(fā)揮最大催化效率的最適溫度和最適pH，B項(xiàng)正確；限制酶催化的是特定部位磷酸二酯鍵的斷裂，屬于水解反應(yīng)，C項(xiàng)正確；限制酶主要從原核生物中分離純化，也有來自真核生物的，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)，在核糖體上合成，D項(xiàng)正確。┃┃變式訓(xùn)練__■1．限制酶是一種核酸切割酶，可辨識(shí)并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下圖為四種限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的辨識(shí)序列。箭頭表示每一種限制酶的特定切割部位，其中哪兩種限制酶所切割出來的DNA片段末端可以互補(bǔ)黏合？其正確的末端互補(bǔ)序列應(yīng)該為(D)A．BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互補(bǔ)序列為—AATT—B．BamHⅠ和HindⅢ；末端互補(bǔ)序列為—GATC—C．EcoRⅠ和HindⅢ；末端互補(bǔ)序列為—AATT—D．BamHⅠ和BglⅡ；末端互補(bǔ)序列為—GATC—解析：A項(xiàng)中BamHⅠ切割出來的末端序列為—GATC—，EcoRⅠ切割出來的末端序列為—AATT—，兩者不能互補(bǔ)黏合；B項(xiàng)中HindⅢ切割出來的末端序列為—AGCT—，與BamHⅠ切割出的末端序列不能互補(bǔ)黏合；同理可推出C項(xiàng)所示兩種限制酶所切割出來的末端也不能互補(bǔ)黏合，只有D項(xiàng)所示兩種限制酶所切割出來的末端才能互補(bǔ)黏合。知識(shí)點(diǎn)與DNA分子相關(guān)的幾種酶的分析1．限制酶與DNA連接酶的比較

項(xiàng)目限制酶DNA連接酶不同點(diǎn)作用使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵應(yīng)用用于提取目的基因和切割載體用于基因表達(dá)載體的構(gòu)建關(guān)系2．DNA連接酶與DNA聚合酶的比較種類DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)催化形成磷酸二酯鍵不同點(diǎn)模板不需要模板需要以DNA的一條鏈為模板作用過程在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個(gè)核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羥基上，形成磷酸二酯鍵作用結(jié)果形成完整的DNA分子形成DNA的一條鏈用途基因工程等DNA復(fù)制3．限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶、解旋酶的作用部位圖解(1)作用于磷酸二酯鍵的酶：限制酶(a斷開)、DNA連接酶(a形成)和DNA聚合酶(a形成)、DNA水解酶(a斷開)。(2)作用于b(氫鍵)的酶：解旋酶。知識(shí)貼士氫鍵的形成是由于分子間的作用力，其斷裂與重新形成均與限制酶、DNA連接酶無關(guān)。┃┃典例剖析__■典例2下列關(guān)于DNA連接酶作用的敘述，正確的是(B)A．將單個(gè)核苷酸加到某個(gè)DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵B．將斷開的2個(gè)DNA片段的骨架連接起來，重新形成磷酸二酯鍵C．連接2條DNA鏈上堿基之間的氫鍵D．只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端連接起來，而不能將兩者之間的平末端進(jìn)行連接解析：DNA連接酶和DNA聚合酶都能催化2個(gè)脫氧核苷酸分子之間形成磷酸二酯鍵。但DNA連接酶是在2個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，將2個(gè)DNA片段連接成重組DNA分子；DNA聚合酶是將單個(gè)的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯鍵，合成新的DNA分子。┃┃變式訓(xùn)練__■2.1972年伯格首先在體外進(jìn)行了DNA改造的研究，成功地構(gòu)建了第一個(gè)體外重組DNA分子。下列相關(guān)敘述正確的是(B)A．不同的DNA分子必須用同一種限制酶切割，才能產(chǎn)生相同的黏性末端B．DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶都能催化形成磷酸二酯鍵C．當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是平末端D．限制酶和DNA連接酶的作用部位不同解析：有些限制酶的識(shí)別序列不同，但可以產(chǎn)生相同的黏性末端，A項(xiàng)錯(cuò)誤；DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶都能催化形成磷酸二酯鍵，B項(xiàng)正確；當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端，C項(xiàng)錯(cuò)誤；限制酶和DNA連接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯鍵，D項(xiàng)錯(cuò)誤。知識(shí)點(diǎn)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”1．載體的功能(1)作為運(yùn)載工具將目的基因轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞內(nèi)。(2)利用它在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。2．常用的載體——質(zhì)粒(1)存在場(chǎng)所：細(xì)菌、真菌等生物的細(xì)胞質(zhì)。(2)本質(zhì)：環(huán)狀DNA分子。(3)特點(diǎn)：含有標(biāo)記基因。(4)載體必須具備的條件①能在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制。②有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，以便與外源基因連接。③具有某些標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選。④載體應(yīng)對(duì)受體細(xì)胞無毒害作用，否則受體細(xì)胞將受到損傷甚至死亡。知識(shí)貼士基因工程中的載體與載體蛋白的區(qū)別基因工程中的載體載體蛋白來源細(xì)菌的質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)作用將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，并能在宿主細(xì)胞中對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制運(yùn)載要進(jìn)出細(xì)胞的某些物質(zhì)┃┃典例剖析__■典例3作為基因的運(yùn)輸工具——載體，必須具備的條件之一及理由是(A)A．能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因B．具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)C．具有某些標(biāo)記基因，以使目的基因能夠與其結(jié)合D．對(duì)受體細(xì)胞無傷害，以便于重組DNA的鑒定和選擇解析：作為載體必須能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因，A正確；作為載體必須具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的插入，而不是表達(dá)，B錯(cuò)誤；作為載體必須具有標(biāo)記基因，以便于重組DNA的鑒定和選擇，C錯(cuò)誤；作為載體必須是安全的，對(duì)受體細(xì)胞無害，以便受體細(xì)胞能進(jìn)行正常的生命活動(dòng)，D錯(cuò)誤。┃┃變式訓(xùn)練__■3．下列關(guān)于質(zhì)粒運(yùn)載體的說法，正確的是(A)①使用質(zhì)粒運(yùn)載體是為了把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在②質(zhì)粒運(yùn)載體只能與目的基因重組后進(jìn)入細(xì)胞③質(zhì)粒運(yùn)載體可能是根據(jù)細(xì)菌或者病毒的DNA改造的④質(zhì)粒運(yùn)載體的復(fù)制和表達(dá)也遵循中心法則⑤質(zhì)粒運(yùn)載體只有把目的基因整合到受體細(xì)胞的DNA中才能表達(dá)⑥沒有限制酶就無法使用質(zhì)粒運(yùn)載體A．①④⑥ B．②③④C．①②⑤ D．③④⑥解析：使用質(zhì)粒運(yùn)載體是為了把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并使目的基因在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保存，①正確；質(zhì)粒運(yùn)載體本身也可以進(jìn)入細(xì)胞，不是與目的基因重組后才能進(jìn)入細(xì)胞，②錯(cuò)誤；質(zhì)粒運(yùn)載體可能是根據(jù)細(xì)菌DNA改造的，而病毒沒有質(zhì)粒，③錯(cuò)誤；質(zhì)粒運(yùn)載體的復(fù)制和表達(dá)也遵循中心法則，這是基因工程設(shè)計(jì)的原理之一，④正確；質(zhì)粒運(yùn)載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并穩(wěn)定存在即可表達(dá)，不一定要把目的基因整合到受體細(xì)胞的DNA中才能表達(dá)，⑤錯(cuò)誤；質(zhì)粒是環(huán)狀DNA分子，將目的基因與質(zhì)粒重組需要使用限制酶，因此沒有限制酶就無法使用質(zhì)粒運(yùn)載體，⑥正確，綜上所述①④⑥正確，故選A。知識(shí)點(diǎn)DNA的粗提取與鑒定1．實(shí)驗(yàn)材料的選取原則上，凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大。選取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。2．方法步驟(1)粗提取DNA(2)鑒定DNA試管編號(hào)A(對(duì)照組)B(實(shí)驗(yàn)組)步驟12mol·L－1的NaCl溶液5mL2mol·L－1的NaCl溶液5mL步驟2不進(jìn)行任何處理加絲狀物或沉淀物步驟3加4mL二苯胺試劑，混勻加4mL二苯胺試劑，混勻步驟4沸水浴5min沸水浴5min實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象溶液不變藍(lán)色溶液逐漸變?yōu)樗{(lán)色實(shí)驗(yàn)結(jié)論DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色特別提醒：(1)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。(2)不用哺乳動(dòng)物的血液作為實(shí)驗(yàn)材料，這是因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器，不含DNA。(3)加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。(4)沉淀DNA時(shí)必須用冷酒精。預(yù)冷的酒精溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少斷裂。(5)二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。┃┃典例剖析__■典例4下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是(B)A．該實(shí)驗(yàn)不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料B．DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它不溶于2mol·L－1的NaCl溶液C．該實(shí)驗(yàn)中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精可用來析出DNAD．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行沸水浴加熱解析：由于哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器，因此不能作為提取DNA的材料，A正確；DNA可溶解在2mol·L－1的NaCl溶液中，B錯(cuò)誤；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精，因此提取DNA時(shí)，加入預(yù)冷的、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液可以除去蛋白質(zhì)、析出DNA，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，D正確。┃┃變式訓(xùn)練__■4．在“DNA的粗提取和鑒定”實(shí)驗(yàn)中，甲、乙、丙、丁四個(gè)小組除下表中所列處理方法不同外，其他操作步驟均正確，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻不同。下列有關(guān)敘述不正確的是(D)組別實(shí)驗(yàn)材料提取核物質(zhì)時(shí)加入的溶液去除雜質(zhì)時(shí)加入的溶液DNA鑒定時(shí)加入的試劑甲雞血蒸餾水體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液(25℃)二苯胺乙菜花蒸餾水體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液(冷卻)雙縮脲試劑丙豬血蒸餾水體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液(冷卻)二苯胺丁雞血蒸餾水體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液(冷卻)二苯胺A．實(shí)驗(yàn)材料選擇錯(cuò)誤的組別是丙B．沸水浴后試管中溶液顏色變藍(lán)的組別是甲、丁C．甲組實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象差的原因是25℃的酒精溶液對(duì)DNA的凝集效果差D．乙組實(shí)驗(yàn)不成功僅因?yàn)樵阼b定時(shí)加入了雙縮脲試劑解析：雞血、菜花細(xì)胞中都含有DNA，而豬是哺乳動(dòng)物，其成熟的紅細(xì)胞中不含DNA，A項(xiàng)正確；甲、乙、丁的實(shí)驗(yàn)材料中都含有DNA，但乙為植物，將植物細(xì)胞放入蒸餾水中時(shí)，植物細(xì)胞不會(huì)吸水漲破，且DNA應(yīng)該用二苯胺鑒定，而不能用雙縮脲試劑鑒定，因此沸水浴后試管中溶液顏色變藍(lán)的組別是甲、丁，但因?yàn)?5℃的酒精溶液對(duì)DNA的凝集效果差，所以甲組藍(lán)色淺，B、C項(xiàng)正確，D項(xiàng)錯(cuò)誤。指點(diǎn)迷津·撥云見日選擇限制酶的方法根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)、質(zhì)粒上的限制酶切割位點(diǎn)以及是否破壞目的基因和標(biāo)記基因來確定限制酶的種類。(1)應(yīng)選擇酶切位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ；不能選擇酶切位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。(2)為避免目的基因及質(zhì)粒的自身環(huán)化、正向連接、反向連接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和質(zhì)粒(雙酶切)，如圖甲可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點(diǎn))。(3)切割質(zhì)粒的限制酶不能同時(shí)切開質(zhì)粒上的所有標(biāo)記基因，即至少要保留一個(gè)標(biāo)記基因，以用于重組DNA的鑒定和選擇，如圖乙中的質(zhì)粒不能使用SmaⅠ切割。知識(shí)貼士不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一個(gè)DNA分子用不同限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。┃┃典例剖析__■典例5利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構(gòu)建重組DNA。限制性內(nèi)切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)分別如下圖所示(已知這三種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同)。下列分析錯(cuò)誤的是(D)A．構(gòu)建重組DNA時(shí)，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體B．構(gòu)建重組DNA時(shí)，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體C．圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRⅠ切割后，含有兩個(gè)游離的磷酸基團(tuán)D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只能產(chǎn)生一種重組DNA解析：構(gòu)建重組DNA時(shí)，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，目的基因兩端將形成不同的黏性末端，同樣P1噬菌體載體也形成這兩種黏性末端，因此它們可構(gòu)成重組DNA，A項(xiàng)正確；分析圖甲，HindⅢ的酶切位點(diǎn)在第二個(gè)EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)的左側(cè)，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因兩端將形成不同的黏性末端，同樣用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌體載體也形成這兩種黏性末端，因此它們可構(gòu)成重組DNA，B項(xiàng)正確；P1噬菌體載體為環(huán)狀DNA，其上只含有一個(gè)EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，因此用EcoRⅠ切割后，該環(huán)狀DNA分子變?yōu)殒湢頓NA分子，因每條DNA單鏈各含有一個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，故切割后含有兩個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，C項(xiàng)正確；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體后形成的黏性末端相同，可正向連接或反向連接，不止能產(chǎn)生一種重組DNA，D項(xiàng)錯(cuò)誤。解疑答惑從社會(huì)中來?P70提示：用到的“分子工具”：限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶、載體。限制性內(nèi)切核酸酶的特征：準(zhǔn)確切割DNA分子，得到所需要的目的基因。DNA連接酶的特征：能將目的基因連接到載體上。載體的特征：能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中。旁欄思考1?P71提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是其在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，限制酶就是一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，原核生物會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，從而保護(hù)自身的作用。旁欄思考2?P72提示：不是一回事?；蚬こ讨兴玫倪B接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E．coliDNA連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到的，稱為T4DNA連接酶。這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯鍵(在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥基之間形成)，那么，二者的差別主要表現(xiàn)如下：(1)DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。(2)DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。思考·討論?P731．提示：“剪刀”代表限制酶，“透明膠條”代表DNA連接酶。2．提示：如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)，可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選擇不對(duì)(也可能是其他原因)。比如在書寫將要重組的兩個(gè)DNA分子時(shí)，一定要具有同一種限制酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)，這樣切割后才會(huì)露出相同的黏性末端；否則黏性末端不同，堿基就無法配對(duì)。3．提示：不能。真正的基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段，且含有幾百至幾千個(gè)不等的堿基對(duì)。探究·實(shí)踐?P74結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1．提示：觀察提取的DNA顏色：如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯胺法鑒定：二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新提取。2．提示：本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品中有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。3．提示：本實(shí)驗(yàn)可以采取分組的方式進(jìn)行。可以選取不同的實(shí)驗(yàn)材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對(duì)同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好。進(jìn)一步探究提示：DNA純化常用方法：將DNA黏稠物再溶解，繼續(xù)用物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍舊沿一個(gè)方向不停攪拌3min，使DNA充分溶解，以免損失。用3～4層紗布進(jìn)行過濾(或離心)，濾去雜質(zhì)，收集含有DNA的濾液。向?yàn)V液中貼壁緩慢加入50mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，并用玻璃棒朝一個(gè)方向緩慢、均勻地?cái)嚢?，溶液中?huì)出現(xiàn)DNA絲狀物。此外，還有許多其他方法。例如，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開。隨后，加入氯仿—異丙醇混合液(體積比為24∶1)，通過離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去，取上清液?？芍貜?fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚處理后，離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性存在于酚層中，這時(shí)可用分液漏斗或吸管等儀器將二者分開。練習(xí)與應(yīng)用?P74一、概念檢測(cè)1．C提示：DNA連接酶的作用是連接兩個(gè)DNA分子片段，既能連接黏性末端，也能連接平末端，形成磷酸二酯鍵。DNA聚合酶的作用是將單個(gè)脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。2．A提示：基因工程中使用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等。二、拓展應(yīng)用1．提示：細(xì)菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA，是因?yàn)榧?xì)菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別序列，或者通過甲基化將甲基轉(zhuǎn)移到限制酶所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。2．提示：(1)限制酶XbaⅠ。因?yàn)橄拗泼竂baⅠ切割B片段產(chǎn)生的黏性末端與限制酶SpeⅠ切割A(yù)片段產(chǎn)生的黏性末端相同。(2)識(shí)別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。同尾酶使構(gòu)建載體時(shí)，切割位點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大。例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有該限制酶的識(shí)別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時(shí)，目的基因就很可能被切斷；這時(shí)可以考慮用合適的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的識(shí)別序列)來獲取目的基因。訓(xùn)練鞏固·課堂達(dá)標(biāo)1．下列敘述符合基因工程概念的是(B)A．在細(xì)胞內(nèi)直接將目的基因與宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行重組，賦予生物新的遺傳特性B．將人的干擾素基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人的干擾素的菌株C．用紫外線照射青霉菌，使其DNA發(fā)生改變，通過篩選獲得青霉素高產(chǎn)菌株D．自然界中天然存在的噬菌體自行感染細(xì)菌后，其DNA整合到細(xì)菌DNA上解析：基因工程又叫重組DNA技術(shù)，是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技