大鼠糖尿病模型的建立

大鼠糖尿病模型的建立

謝菲諾明斯圖爾特是氨基葡萄糖-亞硝基和dns-烷基化試劑，可選擇性損傷動物胰島細胞。現(xiàn)在，它是一種廣泛使用的糖尿病動物模型化學誘導劑。大鼠糖尿病模型造模成功的判斷指標,研究中多采用檢測血糖、血清胰島素水平、C肽值和口服糖耐量(OGTT)等。為了觀察糖尿病早期的病理變化,同時也為了給藥物篩選實驗提供早期檢測參數(shù),本實驗采用不同劑量的STZ來誘導SD大鼠糖尿病,研究不同的生化以及病理指標在糖尿病發(fā)生早期的變化,篩選和確定糖尿病大鼠成模早期敏感的器官和生化指標。1材料和方法1.1stz檸檬酸三鈉5D-2型微量血糖測定儀(北京怡成生物電子技術有限公司);JJ2000Y型電子天平(常熟雙杰測試儀器廠);STZ(Sanland公司產(chǎn)品,批號:s100325);檸檬酸(批號:20090306);檸檬酸三鈉(批號:20080301),分析純(廣州化學試劑廠);INS放免試劑盒(北京科美東雅生物技術有限公司,批號:20091225);C肽放免試劑盒(北京科美東雅生物技術有限公司,批號:20091225)。1.2實驗動物中心SPF級雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±10)g,購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心,許可證號:SCXK(粵)2003-0001,飼養(yǎng)于廣州解放軍第458醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心。采用標準化飼養(yǎng)房鼠籠喂養(yǎng),飼以標準顆粒飼料,自由飲水。1.3實驗方法1.3.1尾尖采血實驗大鼠適應性飼養(yǎng)1周,飲食正常,體質(zhì)量不減輕,且尾尖采血測定血糖值正常的大鼠,選用于實驗。造模前1d下午5:00大鼠開始禁食不禁水,第2天上午9:0060只大鼠隨機分成5組,每組12只。1.3.2實驗大鼠stz的造模實驗STZ用檸檬酸鹽緩沖液(0.1mol/L、pH4.5)配成質(zhì)量濃度為5.0mg/mL的溶液,避光冰浴放置備用。各組實驗大鼠按照以下劑量一次性腹腔注射STZ溶液:正常組(檸檬酸鹽緩沖液)、20mg組(STZ20mg/kg)、30mg組(STZ30mg/kg)、50mg組(STZ50mg/kg)和80mg組(STZ80mg/kg)。造模后每天測量大鼠體質(zhì)量與血糖,血糖值超過16.7mmol/L的為糖尿病大鼠,實驗觀察期為10d。1.3.3血清中的胰島素和c基因含量1.3.4小鼠肝腎功能異常指標量化指標造模后第9天大鼠麻醉取血后處死,解剖檢查臟器,分別取心、肝、脾、肺、腎、胰腺、主動脈、睪丸和眼球等共9個臟器,用10%(φ)中性甲醛溶液固定48h后,取材作常規(guī)石蠟包埋切片。用OLYMPUSBX41光學顯微鏡觀察組織病理學變化并拍照。用Image-ProExpressC圖像分析系統(tǒng)進行腎小球的平均橫截面積(MGA)、腎小球平均體積(MGV)及胰島細胞數(shù)目等定量指標分析。腎小球平均橫截面積(MGA):每張切片隨機測量20個腎小球的橫截面積,取均值;腎小球平均體積(MGV)根據(jù)公式MGV=1.5×MGA3/2;胰島數(shù)目:每張切片計算5個視野中胰島的總和。眼球病理改變分類:(–):無明顯病理學改變;(+):晶狀體上皮細胞排列不規(guī)則,部分細胞呈空泡樣變性,局部見復層排列,晶狀體纖維排列整齊;(++):晶狀體上皮細胞排列不規(guī)則,部分細胞呈空泡樣變性,淺層皮質(zhì)的晶狀體纖維腫脹,排列紊亂,紋理不清;(+++):晶狀體上皮細胞排列不規(guī)則,局部細胞遺留空泡樣輪廓,細胞核消失。大部分晶狀體纖維腫脹,排列紊亂,紋理不清,可見大小不等的球樣Morgagnian小體。1.4統(tǒng)計方法采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析,組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1成模率及死亡率實驗結束時,20mg組無大鼠的血糖值超過16.7mmol/L,也無大鼠死亡,成模率與死亡率都為0;30mg組成模率為16.7%,死亡率為0;50mg組的成模率為91.7%,死亡率為0;80mg組的成模率為58.3%,死亡率為33.4%,見表1。2.2空腹血糖和隨機血糖從造模開始到實驗結束,正常對照組、20mg組、30mg組和50mg組的大鼠平均體質(zhì)量,與實驗前相比,分別增加27.5g、27.9g、17.9g和10.9g,而80mg組的大鼠平均體質(zhì)量下降了23g,見圖1。實驗過程中,20mg組大鼠空腹及隨機血糖一直沒有升高,維持在正常的血糖值范圍內(nèi)(<6mmol/L);30mg組大鼠空腹血糖一直維持在正常范圍內(nèi)(<6mmol/L),隨機血糖值在造模后第2天開始升高,第4天后開始下降,5d后大部分大鼠血糖值下降到正常范圍值內(nèi),只有2只大鼠的血糖值超過了16.7mmol/L;造模后第3天,50mg組個別大鼠空腹血糖小幅度升高,到實驗結束約有90%大鼠空腹血糖值超過16.7mmol/L,而隨機血糖大部分都超過了16.7mmol/L。80mg組的大鼠從造模開始到實驗結束,空腹及隨機血糖值一直維持在高位,血糖值都超過16.7mmol/L(圖2)。2.3兩組c肽含量比較實驗結束時80mg組大鼠血清胰島素含量大幅下降,與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),C肽含量與正常組比較顯著下降(P<0.05),見表2。2.4stz對大鼠、胰腺、眼睛、心臟、肝臟、脾臟、肺、動脈和睪丸的影響2.4.1腎血管基質(zhì)病變50mg和80mg組的腎臟質(zhì)量明顯增加,與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。30mg、50mg和80mg組的腎小球血管基質(zhì)增生、腎小管水樣變性較多,無腎臟壞死的現(xiàn)象,見表3、圖3A。正常組與80mg、50mg、30mg組比較,MGA、MGV值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01),見表4。2.4.2大鼠胰島計數(shù)30mg、50mg和80mg組在實驗結束時,部分大鼠出現(xiàn)胰島細胞變性、壞死的情況,胰島數(shù)量大幅減少,30mg、50mg和80mg組胰島總數(shù)與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表5、圖3B。2.4.3視網(wǎng)膜結構及組織形態(tài)觀察正常組大鼠眼球角膜結構完整,未見缺損,視網(wǎng)膜各層排列有序,連接緊密,未見剝離現(xiàn)象,血管未見擴張或狹窄;局部晶狀體上皮呈復層排列,晶狀體纖維排列整齊。20、30、50、80mg組大鼠眼球角膜結構完整,未見缺損,視網(wǎng)膜各層排列有序,連接緊密,未見剝離現(xiàn)象,血管未見擴張或狹窄。20mg組大鼠(2/12)、30mg組大鼠(3/12)、50mg組大鼠(4/11)、80mg組大鼠(5/7)出現(xiàn)局部晶狀體上皮呈復層排列,纖維排列紊亂。80mg組大鼠(2/7)出現(xiàn)晶狀體上皮細胞排列不規(guī)則,部分細胞呈空泡樣變性,淺層皮質(zhì)的晶狀體纖維腫脹,排列紊亂,紋理不清。見表6、圖3C。2.4.4不同劑量的stz對糖尿病大鼠的心臟、肺、肝臟、脾臟、動脈和睪丸的影響各組大鼠心臟、肺、肝臟、脾臟、主動脈和睪丸均無病理性變化。3不同stz劑量對大鼠血糖的影響STZ是由無色素原鏈霉菌屬產(chǎn)生的一種廣譜抗生素,具有抗腫瘤的作用及致糖尿病的副作用。其引起糖尿病的機制主要有以下幾種:(1)STZ直接經(jīng)由葡萄糖轉(zhuǎn)運體2(GLUT2)進入胰島β細胞,使DNA烷基化,造成DNA損傷,進而誘發(fā)多聚ADP核糖基化作用,耗竭胰島β細胞內(nèi)NAD+和ATP含量,最終導致胰島β細胞壞死。(2)通過氧化亞氮(NO)和自由基2種途徑損傷胰島β細胞DNA,并進一步誘導多聚ADP核糖基化作用,導致胰島β細胞大量壞死。(3)STZ損傷胰島β細胞后,激活自身免疫過程,累及胰島β細胞的生存。由于采用STZ誘導的糖尿病模型具有成?？焖?、穩(wěn)定、高血糖維持時間長等優(yōu)點,目前已成為廣泛采用的糖尿病動物模型化學誘導劑。1型糖尿病造模一般選用的動物是SD大鼠或Wistar大鼠,造模所用的STZ劑量從40~80mg/kg不等。當空腹大鼠經(jīng)腹腔或靜脈注射了STZ后,大鼠可表現(xiàn)為高血糖、多飲、多食、多尿和體質(zhì)量減輕等典型糖尿病癥狀。研究顯示,血糖的變化與STZ劑量有明顯的相關關系,劑量過低,不足以造成胰島細胞的顯著破壞引起高血糖,只有胰島細胞大量損傷時,才會導致高糖血癥;而劑量過大,則會導致造模動物急性死亡。本實驗采用了20、30、50、80mg/kg劑量的STZ,研究誘導1型糖尿病大鼠模型所需的STZ劑量。從注射STZ24h后開始監(jiān)測實驗大鼠各項生理指標。其中20mg組大鼠各生化指標無明顯變化,血糖維持在正常值范圍內(nèi),多個器官病理檢查未發(fā)現(xiàn)異常情況,說明該劑量的STZ不能誘導SD大鼠出現(xiàn)糖尿病;30mg組進食、飲水正常,空腹血糖正常,隨機血糖出現(xiàn)波動,從造模后第3天開始升高,第5天開始下降,病理檢查發(fā)現(xiàn)這些大鼠腎臟及眼球都出現(xiàn)輕微的病變,胰島數(shù)量減少,說明30mg劑量的STZ已經(jīng)能夠輕微損傷大鼠的胰島,該組大鼠的隨機血糖從升高到恢復正常,可能與大鼠胰腺的代償作用有關;50mg組大部分大鼠出現(xiàn)“三多”現(xiàn)象,空腹與隨機血糖明顯升高,胰腺、腎臟和眼球都出現(xiàn)了較嚴重的損傷,胰島數(shù)量明顯減少,說明該組大鼠的胰島細胞損傷較嚴重,胰腺自身的代償作用已不能維持大鼠的生理血糖水平,到造模后第9天隨機血糖和空腹血糖都持續(xù)升高;80mg組大鼠出現(xiàn)典型的1型糖尿病“三多一少”現(xiàn)象,體型消瘦,體質(zhì)量下降,眼球、腎臟以及胰腺病變嚴重,胰島數(shù)量比正常組大鼠減少了1/3,個別大鼠死亡。實驗中發(fā)現(xiàn)在STZ造模的早期,不同STZ劑量組血糖存在明顯不同的動態(tài)變化。正常組與20mg組的空腹血糖和隨機血糖始終都趨于正常;30mg組的隨機血糖在第3~5天左右略有升高;50mg組隨機血糖從造模之初就開始顯著升高,但空腹血糖卻在1周之后才開始顯著升高;80mg組,無論隨機血糖還是空腹血糖,從造模之初就開始顯著升高。由此可見,用STZ進行糖