溶藻弧菌分離及其耐藥性研究

溶藻弧菌分離及其耐藥性研究

溶藻弧菌（va）屬于嗜鹽細(xì)菌和嗜鹽菌，廣泛分布于世界各地的海水和河流入?？?。這是中國(guó)海洋的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。該菌是水生動(dòng)物的主要致病菌,可通過(guò)受損的魚(yú)類(lèi)皮膚和口腔而引發(fā)感染,并可導(dǎo)致人類(lèi)的多種疾病,包括皮膚表面?zhèn)诟腥竞蜐?、蜂窩組織炎、壞死性筋膜炎,耳部中耳炎和外耳炎,眼部結(jié)膜炎、骨髓炎、腦膜炎以及敗血癥等,近年來(lái)的研究證實(shí),該菌與副溶血弧菌一樣,是沿海地區(qū)腹瀉病和食物中的常見(jiàn)病原菌?？股卦跐O業(yè)的大量使用會(huì)使病原菌對(duì)藥物的敏感性下降甚至消失,增加了病害的防治難度,并且對(duì)抗生素的耐藥的食源性細(xì)菌可以通過(guò)食物鏈傳遞給人類(lèi),同時(shí)也可能將耐藥基因轉(zhuǎn)移給其他致病菌和環(huán)境菌株。國(guó)內(nèi)外關(guān)于溶藻弧菌耐藥性的研究主要的研究對(duì)象是食物中毒菌株和臨床分離菌株,而對(duì)于環(huán)境中溶藻弧菌的耐藥性研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)在食物中毒高發(fā)的夏季,在上海臨港海域近海水中分離出33株溶藻弧菌,并對(duì)分離菌株進(jìn)行了20種常見(jiàn)抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn),旨在了解上海臨港海域的溶藻弧菌分布及其耐藥性情況,并為人類(lèi)臨床和獸醫(yī)用藥及進(jìn)行食源性疾病控制提供參考依據(jù)。1材料和方法1.1材料和試劑溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17749上海復(fù)祥生物公司;大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922獲贈(zèng)于上海出入境檢驗(yàn)檢疫局;樣品100份樣品均在2012年6~9月采集于上海臨港地區(qū),使用無(wú)菌采樣器采集水下10~20cm深處海水,并于3h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理;細(xì)菌學(xué)蛋白胨、硫檸膽蔗瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)及胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)上海市浦東新區(qū)疾病預(yù)防控制中心;科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基(CV)上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司;PCR反應(yīng)試劑盒及所用引物等生工生物(上海)有限公司;MH(MuellerHintonAgar)瓊脂培養(yǎng)基及20種抗生素藥敏試紙片杭州天和微生物試劑有限公司。ClassIIBSC生物安全柜新加坡ESCO公司;PTC-200PCR儀及GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1溶藻弧菌的分離培養(yǎng)所有樣品均使用含30g/LNaCl的堿性蛋白胨水,37℃,120r/min振蕩培養(yǎng)18~24h,用接種環(huán)挑取培養(yǎng)液于TCBS平板劃線,于37℃培養(yǎng)18~24h。挑取TCBS上的圓潤(rùn)黏稠的黃色單菌落純化2~3次后,接種于CV培養(yǎng)基平板,于37℃培養(yǎng)18~24h,觀察菌落特征,溶藻弧菌在CV培養(yǎng)基上的典型菌落為透明或半透明、光滑濕潤(rùn)的白色菌落。挑取疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色、10%NaCl嗜鹽性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初篩,實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn),并以溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17749作對(duì)照。1.2.2rt-pcr擴(kuò)增溶藻弧菌及擴(kuò)增條件初篩后的菌株接種于含3%NaCl的TSB液體培養(yǎng)基中于37℃,120r/min振蕩培養(yǎng)(12±2)h。采用水煮法提取DNA:取純培養(yǎng)物1mL于10000r/min離心5min,棄上清,用500μL無(wú)菌生理鹽水懸浮菌體,置于干式恒溫儀100℃保持10min,0℃保持10min,10000r/min離心3min,取上清液儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩SP60是溶藻弧菌的特征基因,在GenBank中登錄號(hào)為AY332570,若分離菌株經(jīng)PCR可擴(kuò)增出560bp的條帶,則判定為溶藻弧菌。其上下游引物序列分別為:P1:5’ACAACAGCAACGGTACTAGC3’和P2:5’CAACTTTCACGATGCCAC3’,反應(yīng)體系20μL:2×PCRMaster10μL、ddH2O7μL、DNA模板1μL、上下游引物各1μL。PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性6min;94℃變性30s,55℃退火35s,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán);72℃再延伸10min,4℃冷卻。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用100V電壓,1%瓊脂糖凝膠電泳40min。1.2.3抗菌活性的測(cè)定采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer)測(cè)定分離菌株對(duì)20種抗生素的敏感性。分別挑取在TCBS上培養(yǎng)18~24h的各菌株單菌落于含3%NaCl的TSB培養(yǎng)基中37℃、120r/min振蕩培養(yǎng)6~8h,用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞舛?OD625=0.08~0.13)。取200μL菌液至直徑為90mm的無(wú)菌平皿中,定量加入滅菌后冷卻至46℃左右的MH瓊脂培養(yǎng)基25mL(含1%NaCl),充分混勻,靜置20~30min后貼藥敏試紙片。每種抗生素貼2個(gè)藥敏試紙片,每個(gè)平板貼5片。(35±1)℃培養(yǎng)16~18h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈,實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀參照文獻(xiàn),以大腸桿菌ATCC25922為參考菌株進(jìn)行質(zhì)控。20種抗生素的含量及耐藥折點(diǎn)見(jiàn)表1。2結(jié)果與分析2.1菌落的選擇100份海水樣品增菌液中有42份在TCBS平板獲得黃色菌落,將其純化并轉(zhuǎn)接到CV培養(yǎng)基中,得到透明或半透明、邊緣光滑、表面濕潤(rùn)的白色菌落33份。將33株疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色、10%NaCl嗜鹽性生長(zhǎng)和ONPG實(shí)驗(yàn)三種生化指標(biāo)的鑒定,結(jié)果均為革蘭氏陰性短桿菌,能夠在含10%NaCl的堿性蛋白胨中生長(zhǎng)和ONPG陰性,與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17749的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。2.2溶藻弧菌特異性基因檢測(cè)提取33株疑似菌株的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),電泳圖譜顯示所有菌株均在560bp出現(xiàn)條帶,即擴(kuò)增出溶藻弧菌特異性基因HSP60。部分溶藻弧菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。2.3溶藻弧菌對(duì)20種抗菌藥的耐藥性33株溶藻弧菌對(duì)抗生素均存在不同的耐藥性(見(jiàn)表2),其中DH030對(duì)羧芐青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、頭孢哌酮、氨芐青霉素/舒巴坦、慶大霉素、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、多粘菌素B和痢特靈共11種抗生素具有耐藥性,其耐藥率高達(dá)55.0%;DH024對(duì)羧芐青霉素、萬(wàn)古霉素和利福平具有耐藥性,DH031對(duì)羧芐青霉素、氨芐青霉素和萬(wàn)古霉素具有耐藥性,耐藥率均為15.0%。其他菌株對(duì)20種抗生素的耐藥率在20.0%~50.0%之間。比較33株溶藻弧菌對(duì)20種抗生素的耐藥性(見(jiàn)圖2),可以得到如下結(jié)論:溶藻弧菌對(duì)氨芐青霉素、羧芐青霉素和萬(wàn)古霉素有很高的耐藥性;對(duì)頭孢吡肟、安曲南、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、紅霉素及氯霉素均100.0%敏感;溶藻弧菌對(duì)頭孢1到4代的耐藥率雖不是持續(xù)降低,但對(duì)其藥物敏感性不斷增高;溶藻弧菌對(duì)同類(lèi)抗生素的耐藥性也有很大不同,如氨基糖苷類(lèi)的慶大霉素和丁胺卡那霉素,耐藥率分別為15.2%和72.7%;溶藻弧菌對(duì)某些抗生素雖然耐藥率不高,但也不敏感,處于中介敏感范圍,如頭孢噻吩、頭孢呋辛和復(fù)方新諾明。本次分離的溶藻弧菌均至少對(duì)3種及3種以上抗生素多重耐藥(見(jiàn)表3),同時(shí)對(duì)6種及6種以上抗生素耐藥的有15株,占總數(shù)的45.5%,同時(shí)對(duì)8種及8種以上抗生素耐藥的有6株,占總數(shù)的18.2%。3k-b擴(kuò)散法藥敏實(shí)驗(yàn)溶藻弧菌會(huì)分解TCBS平板中的蔗糖,使其菌落呈黃色,但培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)24h后,部分菌落會(huì)變成綠色,這是由于培養(yǎng)基中的蔗糖被消耗完全所造成的,因此在使用TCBS培養(yǎng)基對(duì)溶藻弧菌進(jìn)行分離時(shí),應(yīng)選擇在37℃生長(zhǎng)24h內(nèi)的典型菌落。同樣能夠在TCBS平板上形成黃色菌落的弧菌還包括霍亂弧菌、鰻弧菌等,但通過(guò)CV培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、10%嗜鹽性實(shí)驗(yàn)和ONPG實(shí)驗(yàn)基本可以排除。因此,在對(duì)溶藻弧菌進(jìn)行分離鑒定時(shí),可先用TCBS和CV平板進(jìn)行選擇性分離,再用革蘭氏染色、10%嗜鹽性實(shí)驗(yàn)和ONPG實(shí)驗(yàn)這三種重要的生理生化指標(biāo)進(jìn)行初步篩選,最后采用分子生物學(xué)方法驗(yàn)證,可在保證分離的準(zhǔn)確性的同時(shí)減少鑒定的工作量。K-B擴(kuò)散法是一種經(jīng)典的藥敏實(shí)驗(yàn)方法,到目前為止,CLSI的推薦方法仍然為用無(wú)菌棉拭子蘸取0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木?擠壓棉拭子上的多余菌液后在MH平板上進(jìn)行涂布。但細(xì)菌的接種量仍然受到棉拭子大小和操作人員對(duì)棉拭子的擠壓程度的影響。在使用培養(yǎng)基、藥敏試紙片的質(zhì)量和藥物含量、培養(yǎng)時(shí)間相同的條件下,細(xì)菌的接種量越大,抑菌圈越小。為消除接種量對(duì)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,本研究在經(jīng)過(guò)質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922對(duì)抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)后,確認(rèn)了本次采用200μL的0.5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙憾拷臃N后傾注培養(yǎng)基的方法能使抑菌圈具有窄的分布范圍和更好的重復(fù)性。本研究從100份海水樣品中共分離得到33株溶藻弧菌,檢出率為33.0%,并且所有分離菌株均表現(xiàn)出多重耐藥性(多重耐藥率為15.0%~55.0%),提示我們?cè)谑秤煤．a(chǎn)品或海產(chǎn)品加工過(guò)程中需采取有效的滅菌措施,防止食源性致病菌引起的食物中毒、阻止耐藥菌株在腸道中將耐藥基因轉(zhuǎn)移給致病性更強(qiáng)的細(xì)菌。在20種抗生素中,溶藻弧菌分離菌株對(duì)羧芐青霉素、氨芐青霉素和萬(wàn)古霉素的耐藥性較高,對(duì)頭孢吡肟、安曲南、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、紅霉素及氯霉素均表現(xiàn)敏感。但不同地點(diǎn)和時(shí)間分離的溶藻弧菌耐藥譜具有很大差異[19,20,21,22,23,24,25],因此有必要對(duì)各地的溶藻弧菌耐藥譜進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,從而選擇合適的藥物來(lái)進(jìn)行對(duì)其引起疾病的防控。近年來(lái)我國(guó)的食品安全問(wèn)題愈發(fā)突出,食源性致病菌的耐藥性對(duì)食品安全及人類(lèi)身體健康的影響已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生一方面是因?yàn)榭股氐膹V泛使用提供了細(xì)菌的耐藥突變形成了選擇性壓力,使耐