新教材適用2023-2024學(xué)年高中生物第3章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序?qū)W案新人教版選擇性必修3

第2節(jié)基因工程的基本操作程序課標(biāo)要求1．闡明基因工程的原理和基本操作程序。2．針對(duì)人類生產(chǎn)或生活中的某一需求，選取適當(dāng)?shù)幕蚬こ痰募夹g(shù)和方法，嘗試設(shè)計(jì)獲得某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方案。3．嘗試進(jìn)行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物。核心素養(yǎng)1．科學(xué)思維——結(jié)合生產(chǎn)實(shí)例，舉例說(shuō)出基因工程的基本操作程序。2．科學(xué)探究——針對(duì)人類生產(chǎn)和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構(gòu)想，完成初步設(shè)計(jì)。知識(shí)點(diǎn)一目的基因的篩選與獲取基礎(chǔ)知識(shí)·雙基夯實(shí)1．目的基因(1)概念：用于改變_受體細(xì)胞性狀__或獲得_預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物__等的基因。(2)實(shí)例：培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉用到的目的基因是_Bt抗蟲(chóng)蛋白基因__。2．獲取方法特別提醒：引物是依據(jù)目的基因的已知序列設(shè)計(jì)而成的，其提供3′端，以便DNA聚合酶催化單個(gè)脫氧核苷酸連接?；顋學(xué)|巧|練1.目的基因只能是編碼蛋白質(zhì)的基因。(×)2．PCR需要的條件與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件完全一致。(×)3．PCR復(fù)性時(shí)，溫度一般為72℃。(×)合|作|探|究1.PCR過(guò)程中為什么需要引物？DNA鏈復(fù)制的方向是怎樣的？提示：DNA聚合酶不能從頭合成子鏈，只能把游離的脫氧核苷酸連接到已經(jīng)存在的片段上。加入引物，能夠使DNA聚合酶從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。DNA鏈復(fù)制的方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。2．PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，復(fù)性溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。復(fù)性溫度過(guò)高會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)，復(fù)性溫度過(guò)低又會(huì)造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結(jié)合。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，假設(shè)引物的長(zhǎng)度相同，在GC含量高時(shí)，對(duì)復(fù)性溫度的設(shè)定有什么要求？說(shuō)明理由。提示：在引物的GC含量高時(shí)，設(shè)定的復(fù)性溫度要高一些。因?yàn)镈NA分子中G—C之間有三個(gè)氫鍵，A—T之間有兩個(gè)氫鍵。3．在利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因時(shí)，從第幾輪循環(huán)才會(huì)產(chǎn)生完整的目的基因？提示：第3輪課內(nèi)探究·名師點(diǎn)睛1．目的基因用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。2．目的基因的獲取方法(1)從基因文庫(kù)中獲取。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增。(3)通過(guò)化學(xué)方法人工合成。3．PCR反應(yīng)(1)條件①模板：DNA母鏈(目的基因所在的DNA片段)。②酶：耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。③兩種引物：分別與兩條模板鏈相結(jié)合。④原料：四種脫氧核苷酸。(2)過(guò)程過(guò)程說(shuō)明圖解變性溫度上升到90℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性溫度下降到50℃左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸溫度上升到72℃左右，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下從引物起始合成互補(bǔ)鏈，可使新鏈由5′端向3′端延伸(3)結(jié)果上述三步反應(yīng)完成后，一個(gè)DNA分子就變成了兩個(gè)DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應(yīng)過(guò)程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。典例1下列關(guān)于PCR反應(yīng)體系中所加物質(zhì)作用的敘述，錯(cuò)誤的是(B)A．耐高溫的DNA聚合酶用于催化DNA子鏈的合成B．引物使TaqDNA聚合酶能從引物的5′端延伸DNA鏈C．目標(biāo)DNA母鏈用作合成DNA復(fù)制的模板D．四種脫氧核苷酸為PCR提供原料解析：通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要用耐高溫的DNA聚合酶催化單個(gè)脫氧核苷酸聚合形成DNA子鏈，A正確；在復(fù)制時(shí)，引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈，因此DNA合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，B錯(cuò)誤；PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制，DNA復(fù)制時(shí)兩條鏈均作為復(fù)制的模板，C正確；DNA合成的原料是四種脫氧核苷酸，D正確。關(guān)于引物①概念：引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。用于PCR的引物長(zhǎng)度一般為20～30個(gè)核苷酸。②作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸，見(jiàn)下圖：③引物類型eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(自然引物(細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制)：主要為RNA,人工引物(PCR)：DNA單鏈(主要)或RNA))變式訓(xùn)練?下圖表示基因工程中獲取水稻某目的基因的不同方法。下列相關(guān)敘述中正確的是(A)A．三種方法都需要酶并均在體外進(jìn)行B．①②③堿基對(duì)的排列順序均相同C．三種方法均屬于人工合成法D．方法a不遵循中心法則解析：這三種方法都是在體外進(jìn)行的，且都用到酶(方法a需要逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正確；通過(guò)方法a得到的目的基因不含有內(nèi)含子，通過(guò)方法c得到的目的基因的堿基序列可能有多種，因此①②③堿基對(duì)的排列順序不一定相同，B錯(cuò)誤；圖示a和c屬于人工合成法，而b是從供體細(xì)胞的DNA中直接分離目的基因的方法，C錯(cuò)誤；方法a遵循中心法則，D錯(cuò)誤。知識(shí)點(diǎn)二基因表達(dá)載體的構(gòu)建基礎(chǔ)知識(shí)·雙基夯實(shí)1．構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的(1)使目的基因在受體細(xì)胞中_穩(wěn)定存在__，并且可以_遺傳__給下一代。(2)使目的基因能夠_表達(dá)__和發(fā)揮作用。2．基因表達(dá)載體的組成[填圖]3．基因表達(dá)載體的構(gòu)建首先用一定的_限制酶__切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口，然后用_同種__限制酶或_能產(chǎn)生相同末端__的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用_DNA連接酶__將目的基因片段拼接到載體的切口處?；顋學(xué)|巧|練1.基因工程操作的核心步驟是目的基因的獲取。(×)2．啟動(dòng)子位于mRNA的上游。(×)3．基因表達(dá)載體中的標(biāo)記基因可用于目的基因的檢測(cè)與篩選。(√)合|作|探|究分析基因表達(dá)載體模式圖，回答下面問(wèn)題：1．構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因應(yīng)在哪個(gè)位置？為什么？提示：由圖可知，目的基因要插入啟動(dòng)子和終止子之間。因?yàn)閱?dòng)子使轉(zhuǎn)錄開(kāi)始，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位；終止子位于基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄終止；只有順序正確目的基因才能正常轉(zhuǎn)錄。2．為什么一般不能將目的基因插入載體的標(biāo)記基因中？提示：標(biāo)記基因用于鑒定受體細(xì)胞是否成功導(dǎo)入目的基因，以便將含目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)，若有目的基因插入，則標(biāo)記基因被破壞，無(wú)法進(jìn)一步篩選。課內(nèi)探究·名師點(diǎn)睛1．基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的(1)使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。(2)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2．地位：基因工程的核心步驟。3．基因表達(dá)載體的組成4．過(guò)程典例2下列有關(guān)基因表達(dá)載體的構(gòu)建的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是(B)①一個(gè)基因表達(dá)載體的組成只包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子②有了啟動(dòng)子才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA③終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止④所有基因表達(dá)載體的構(gòu)建是完全相同的⑤必須在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行A．②③⑤ B．①④⑤C．①②⑤ D．③④解析：基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等，①錯(cuò)誤；啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，②正確；終止子控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束，③正確；由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物以及微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建是不完全相同的，④錯(cuò)誤；基因表達(dá)載體的構(gòu)建必須在細(xì)胞外進(jìn)行，⑤錯(cuò)誤。啟動(dòng)子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子(1)啟動(dòng)子位于基因的上游，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，與終止子一樣都位于DNA片段上，分別控制轉(zhuǎn)錄過(guò)程的啟動(dòng)和終止。(2)起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過(guò)程的啟動(dòng)和終止。變式訓(xùn)練?如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)可食用疫苗的部分過(guò)程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內(nèi)切核酸酶。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(B)A．圖示過(guò)程是基因工程的核心步驟B．表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)需要用到限制酶SmaⅠC．抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細(xì)胞篩選出來(lái)D．除圖示組成外，表達(dá)載體中還應(yīng)該含有啟動(dòng)子和終止子等結(jié)構(gòu)解析：圖示過(guò)程為基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程，是基因工程中的核心步驟；構(gòu)建過(guò)程中需要將目的基因完整切割下來(lái)，此時(shí)要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ；抗卡那霉素基因是標(biāo)記基因，目的是便于鑒定和篩選含有目的基因的細(xì)胞；基因表達(dá)載體包括復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子、目的基因、終止子和標(biāo)記基因等。知識(shí)點(diǎn)三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基礎(chǔ)知識(shí)·雙基夯實(shí)1．轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)_維持穩(wěn)定__和_表達(dá)__的過(guò)程。2．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法(1)目的基因?qū)胫参锛?xì)胞①花粉管通道法Ⅰ.用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入_子房__中。Ⅱ.在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借_花粉管通道__進(jìn)入_胚囊__。②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法Ⅰ.農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：農(nóng)桿菌自然條件下侵染_雙子葉__植物和_裸子__植物；農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的_T－DNA__能夠整合到所侵染細(xì)胞的_染色體DNA__上。Ⅱ.轉(zhuǎn)化方法：將目的基因插入農(nóng)桿菌_Ti質(zhì)粒的T－DNA__中，讓農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞。(2)目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①常用方法：_顯微注射__法。②常用受體細(xì)胞：_受精卵__。(3)目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①方法：用_Ca2＋__處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后將重組表達(dá)載體導(dǎo)入其中。②常用受體細(xì)胞：原核細(xì)胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)?；顋學(xué)|巧|練1.將重組表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物受精卵常用顯微注射法。(√)2．農(nóng)桿菌感染植物的機(jī)理：Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到植物受體細(xì)胞內(nèi)，并且與其染色體DNA整合在一起。(√)3．常用Ca2＋處理植物細(xì)胞，使細(xì)胞可以吸收周?chē)h(huán)境中DNA。(×)合|作|探|究1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)腚p子葉植物和裸子植物的一種方法，原因是雙子葉植物和裸子植物能夠產(chǎn)生一種吸引農(nóng)桿菌的化學(xué)物質(zhì)，而單子葉植物不能產(chǎn)生這種物質(zhì)，能不能利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)雴巫尤~植物？說(shuō)明原因。提示：能，可從雙子葉植物中提取該化合物，再用該化合物處理單子葉植物細(xì)胞，然后就可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞。2．將目的基因?qū)雱?dòng)物的受體細(xì)胞除了受精卵外，還可以選擇什么細(xì)胞？提示：還可以將目的基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞，因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞也能發(fā)育成動(dòng)物體。課內(nèi)探究·名師點(diǎn)睛1．導(dǎo)入的方法受體細(xì)胞類型方法說(shuō)明特點(diǎn)植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→插入植物細(xì)胞中的染色體DNA上→目的基因表達(dá)經(jīng)濟(jì)、有效，適合于雙子葉植物和裸子植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞→目的基因表達(dá)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)動(dòng)物細(xì)胞顯微注射法含目的基因片段的表達(dá)載體受精卵的核內(nèi)→將受精卵移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)→使受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞的最有效的方法微生物細(xì)胞Ca2＋處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)Ca2＋處理微生物細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→將基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合在緩沖液中→在一定溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過(guò)程簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效2.目的基因在受體細(xì)胞中的位置不同會(huì)引起遺傳上的差別(1)圖中a細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，細(xì)胞質(zhì)是不均分的，子細(xì)胞不一定含有目的基因。(2)圖中b在進(jìn)行細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，細(xì)胞核中的DNA經(jīng)復(fù)制后平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，保證了親子代遺傳性狀的穩(wěn)定性，細(xì)胞中目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)。典例3下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的敘述，不正確的是(D)A．花粉管通道法的操作之一是用微量注射器將含有目的基因的溶液直接注入子房中B．顯微注射技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中采用最多的方法C．大腸桿菌最常用的轉(zhuǎn)化方法是使細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變D．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法解析：花粉管通道法的操作之一是用微量注射器將含有目的基因的溶液直接注入子房中，A正確；目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的方法是顯微注射技術(shù)，B正確；大腸桿菌最常用的轉(zhuǎn)化方法是用Ca2＋處理細(xì)胞，使細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變，從而完成轉(zhuǎn)化過(guò)程，C正確；我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的方法是花粉管通道法，D錯(cuò)誤。在將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，都必須進(jìn)行基因表達(dá)載體的構(gòu)建，也就是說(shuō)導(dǎo)入受體細(xì)胞的必須是重組DNA分子，而不是直接導(dǎo)入目的基因。變式訓(xùn)練?農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T—DNA插入植物基因組中。圖示為利用農(nóng)桿菌培育轉(zhuǎn)基因植物的基本流程，請(qǐng)據(jù)圖回答：(1)剪除Ti質(zhì)粒的某些片段、替換復(fù)制原點(diǎn)O與添加抗生素的抗性基因T的過(guò)程①中，需用多種限制酶處理，原因是_不同的限制酶識(shí)別并切割不同的堿基序列__，需用_T4_DNA連接酶__“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。(2)目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的基因__。由過(guò)程②形成的基因表達(dá)載體中，目的基因的上游具有_啟動(dòng)子__，它是_RNA聚合酶__識(shí)別和結(jié)合的部位。(3)過(guò)程③常用_Ca2＋(CaCl2溶液)__處理使農(nóng)桿菌成為感受態(tài)細(xì)胞?？股乜剐曰騎的作用是_用于鑒定和篩選導(dǎo)入了基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌__。解析：(1)Ti質(zhì)粒具多種限制酶切割位點(diǎn)，是因?yàn)椴煌南拗泼缸R(shí)別并切割不同的堿基序列。連接平末端應(yīng)選用T4DNA連接酶。(2)目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。目的基因的上游具有啟動(dòng)子，以便于RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合。(3)過(guò)程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)處理農(nóng)桿菌，以增大農(nóng)桿菌細(xì)胞壁的通透性。抗生素抗性基因T用于檢測(cè)受體細(xì)胞中是否含有基因表達(dá)載體。知識(shí)點(diǎn)四目的基因的檢測(cè)與鑒定基礎(chǔ)知識(shí)·雙基夯實(shí)1．分子水平檢測(cè)(1)通過(guò)_PCR__等技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(2)從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)用相應(yīng)的抗體進(jìn)行_抗原—抗體__雜交，檢測(cè)目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)。2．個(gè)體水平鑒定包括抗蟲(chóng)、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性及抗性程度?；蚬こ坍a(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品活性進(jìn)行比較等?；顋學(xué)|巧|練1.從大腸桿菌細(xì)胞中獲得人胰島素基因的mRNA，說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)。(×)2．通過(guò)PCR技術(shù)可以檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(√)合|作|探|究鑒定導(dǎo)入的抗蟲(chóng)基因是否表達(dá)的最簡(jiǎn)便的方法是什么？提示：用葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲(chóng)，觀察棉鈴蟲(chóng)是否死亡。課內(nèi)探究·名師點(diǎn)睛1．目的基因的檢測(cè)與鑒定2．不同分子檢測(cè)原理的異同(1)檢測(cè)目的基因是否插入受體DNA中、目的基因是否轉(zhuǎn)錄時(shí)，用的探針都是放射性同位素等標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段。檢測(cè)原理都是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，只是被檢測(cè)的物質(zhì)不同，一個(gè)是轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA，一個(gè)是轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞內(nèi)的mRNA。(2)進(jìn)行翻譯水平的檢測(cè)，通常以目的基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))作抗原，制備相應(yīng)抗體，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì)，利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理。(3)不論是復(fù)制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平的檢測(cè)，都是在體外進(jìn)行的?；蚬こ滩僮鬟^(guò)程中堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象基因工程操作過(guò)程中只有第三步“將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞”沒(méi)有堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象；第一步篩選與獲取目的基因，用人工合成、PCR獲取或基因文庫(kù)獲取，三種常用方法都涉及堿基互補(bǔ)配對(duì)；第二步基因表達(dá)載體的構(gòu)建中DNA連接酶連接目的基因與質(zhì)粒載體，第四步利用分子雜交的方法檢測(cè)(DNA、mRNA)，也都存在堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象。典例4在檢測(cè)抗蟲(chóng)棉培育是否成功的方法中，不屬于分子水平檢測(cè)的是(A)A．觀察害蟲(chóng)吃棉葉后是否死亡B．通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)棉花的染色體上是否插入了目的基因C．檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄形成mRNAD．從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交解析：A項(xiàng)屬于個(gè)體水平的鑒定，不是分子水平的檢測(cè)。變式訓(xùn)練?運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)，將蘇云金桿菌的抗蟲(chóng)基因整合到棉花細(xì)胞中，為了檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是否成功，最簡(jiǎn)便的方法是檢測(cè)棉花植株是否有(D)A．抗蟲(chóng)基因 B．抗蟲(chóng)基因產(chǎn)物C．新的細(xì)胞核 D．相應(yīng)的性狀解析：將蘇云金桿菌中的抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)移到棉花的細(xì)胞中，若此棉花抗蟲(chóng)效果明顯的話，說(shuō)明其體內(nèi)就具有細(xì)菌的抗蟲(chóng)基因，因?yàn)樯锏男誀钍怯苫蚩刂频?。知識(shí)點(diǎn)五DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定基礎(chǔ)知識(shí)·雙基夯實(shí)1．實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)(1)PCR原理：利用了_DNA的熱變性__原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。(2)電泳：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。(3)PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的_大小和構(gòu)象__等有關(guān)。2．實(shí)驗(yàn)步驟活|學(xué)|巧|練1.微量移液器在使用前要先消毒。(×)2．PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。(√)合|作|探|究1.判斷是否成功擴(kuò)增出DNA片段的依據(jù)是什么？如果沒(méi)有成功應(yīng)該從哪些方面分析？提示：可以通過(guò)在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)判斷。沒(méi)有成功的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?．如果沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，可能的原因有哪些？提示：模板DNA含有蛋白或含有TaqDNA聚合酶的抑制劑(如蛋白酶K、苯酚、EDTA)；TaqDNA聚合酶失活；引物出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題，濃度不合適；Mg2＋濃度過(guò)低；變性溫度低，變性時(shí)間短；目的序列變異等。課內(nèi)探究·名師點(diǎn)睛1．操作步驟(1)加樣：按照PCR反應(yīng)體系的配方將所有組分加入微量離心管中，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部。(2)反應(yīng)：將微量離心管放入PCR儀中，設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng)(可參照下表內(nèi)容進(jìn)行設(shè)置)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min//30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min(3)制膠：根據(jù)待分離DNA片段的大小，制備瓊脂糖凝膠。一般配制質(zhì)量體積比為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。制好的凝膠放入電泳槽中，加電泳緩沖液，以沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜。(4)點(diǎn)樣：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。(5)電泳：待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。(6)觀察：取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。2．注意事項(xiàng)(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。(2)PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。(3)在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。(4)在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。典例5某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是(D)A．增加模板DNA的量B．延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間C．延長(zhǎng)延伸的時(shí)間D．提高復(fù)性的溫度解析：增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少反應(yīng)非特異性條帶，A錯(cuò)誤；延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間和延長(zhǎng)延伸的時(shí)間會(huì)影響變性、延伸過(guò)程，但對(duì)于延伸中的配對(duì)影響不大，故不能有效減少反應(yīng)非特異性條帶，B、C錯(cuò)誤；非特異性產(chǎn)物增加的原因可能是復(fù)性溫度過(guò)低會(huì)造成引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)增加，故可通過(guò)提高復(fù)性的溫度來(lái)減少反應(yīng)非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。變式訓(xùn)練?利用PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到以下電泳圖譜，其中1號(hào)泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)樣液，10號(hào)泳道為蒸餾水。PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。下列分析錯(cuò)誤的是(B)A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250bp至500bp之間B．3號(hào)樣品為不含目的基因的載體DNAC．9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D．10號(hào)泳道的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有干擾解析：PCR過(guò)程中，可以通過(guò)設(shè)計(jì)特定的引物來(lái)擴(kuò)增特定的DNA片段。4～9號(hào)是轉(zhuǎn)基因植株，理論上應(yīng)包含目的基因，結(jié)合2號(hào)野生型和10號(hào)蒸餾水的結(jié)果，推測(cè)包含目的基因的片段大小應(yīng)為250～500bp；3號(hào)PCR結(jié)果包含250～500bp的片段，說(shuō)明含有目的基因；9號(hào)PCR結(jié)果不包含250～500bp的片段，所以不是所需的轉(zhuǎn)基因植株；10號(hào)放入蒸餾水，是為了排除反應(yīng)體系等因素對(duì)結(jié)果的干擾，由圖可知，10號(hào)泳道的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有干擾。細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的比較項(xiàng)目體內(nèi)DNA復(fù)制PCR反應(yīng)不同點(diǎn)時(shí)期細(xì)胞有絲分裂間期和減數(shù)第一次分裂前的間期體外隨時(shí)進(jìn)行場(chǎng)所活細(xì)胞內(nèi)微量離心管內(nèi)酶解旋酶、DNA聚合酶耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)解旋在解旋酶的作用下，細(xì)胞提供能量，部分解開(kāi)加熱至90℃以上時(shí)，雙鏈全部解開(kāi)，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或單鏈DNA分子片段合成子鏈在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成分別從兩條鏈的引物端開(kāi)始，都是連續(xù)合成，控制溫度在72℃左右特點(diǎn)邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制體外迅速擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制30多次產(chǎn)物完整DNADNA片段相同點(diǎn)原料4種脫氧核苷酸(A、G、C、T)復(fù)制原理嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，半保留復(fù)制模板以DNA母鏈為模板引物都需要分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物典例6PCR過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相比，主要有兩點(diǎn)不同，它們是(C)①PCR過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA②PCR過(guò)程不需要DNA聚合酶③PCR過(guò)程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的④PCR過(guò)程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進(jìn)行復(fù)制A．③④ B．①②C．①③ D．②④解析：PCR過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相比較，主要有兩點(diǎn)不同：一是PCR過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA，長(zhǎng)度通常為20～30個(gè)核苷酸；二是PCR過(guò)程中，DNA解旋不依賴解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。學(xué)|霸|記|憶1.基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的篩選與獲??；(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建；(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；(4)目的基因的檢測(cè)與鑒定。2．PCR反應(yīng)液中需要提供DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。3．PCR反應(yīng)中每次循環(huán)一般可分為變性、復(fù)性、延伸三步。4．基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心，基因表達(dá)載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動(dòng)子、終止子以及標(biāo)記基因等。5．將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法。6．將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用顯微注射技術(shù)，導(dǎo)入微生物細(xì)胞常用感受態(tài)細(xì)胞法(Ca2＋處理法)。7．分子水平的檢測(cè)：檢測(cè)目的基因是否插入受體細(xì)胞的DNA中；檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；檢測(cè)目的基因是否翻譯出相應(yīng)蛋白質(zhì)。8．目的基因的檢測(cè)與鑒定還需要在個(gè)體生物學(xué)水平進(jìn)行鑒定。1．下圖是利用基因工程培育抗蟲(chóng)植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是(A)A．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異B．③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上C．④的染色體上若含抗蟲(chóng)基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀D．②的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶參與解析：⑤為轉(zhuǎn)基因植物，只要表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀就說(shuō)明轉(zhuǎn)入的目的基因成功表達(dá)了，基因工程的原理是基因重組，屬于可遺傳變異，A項(xiàng)正確；③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒上的T－DNA整合到棉花細(xì)胞的染色體上，B項(xiàng)錯(cuò)誤；受體細(xì)胞的染色體上可能含抗蟲(chóng)基因，但不代表該基因就一定成功表達(dá)，因此不能確定⑤是否表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀，C項(xiàng)錯(cuò)誤；基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶參與，D項(xiàng)錯(cuò)誤。2．如圖為某質(zhì)粒限制酶酶切圖譜。某基因不含圖中限制酶識(shí)別序列。為使PCR擴(kuò)增的該基因重組進(jìn)該質(zhì)粒，則擴(kuò)增的該基因兩端需分別引入哪兩種限制酶的識(shí)別序列(A)A．NdeⅠ和BamHⅠ B．NdeⅠ和XbaⅠC．XbaⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和Kp