生物化學與分子生物學開題報告

PAGE2開題報告書論文題目鯉魚鱗膠原蛋白多肽的提取及其活性研究開題人姓名學號專業(yè)導師姓名二零一一年七月十二日論文題目鯉魚鱗膠原蛋白多肽的提取及其活性研究該題目研究的目的、意義魚在加工的過程中，會產(chǎn)生大量的下腳料，其重量約占原料魚的40%-55%。如果不進行有效處理，不僅會造成環(huán)境的污染，而且會浪費大量的寶貴資源。我國每年魚的廢棄物總量達200萬t以上，其中魚鱗約占15%，即30萬t。廢棄魚鱗的數(shù)量隨著水產(chǎn)品加工總量而逐年增加。魚鱗中主要成分是I型膠原，而膠原蛋白的經(jīng)濟價值是很高的。因此，開發(fā)利用水產(chǎn)加工廢棄物的膠原蛋白，生產(chǎn)具有各種生理功能的活性肽，用于食品、保健品、化妝品和醫(yī)藥原料等，提高我國水產(chǎn)品加工，特別是淡水魚加工的經(jīng)濟附加值，同時避免造成環(huán)境污染，具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。魚鱗富含蛋白質(zhì)，其中含有10-40%膠原蛋白、7%的磷脂、灰分30%;脂質(zhì)含量少，相對目前生產(chǎn)膠原蛋白的主要原料豬皮與牛皮而言，這更有利于膠原蛋白的提取與純化。膠原蛋白是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，由于其獨特的生理生化性質(zhì)而被廣泛地應用于生物醫(yī)學材料和臨床治療、食品、化妝品工業(yè)等領(lǐng)域。長期以來，豬皮、牛皮等陸生動物皮是膠原蛋白主要來源。近年來，由于宗教信仰和人們對瘋牛病、口蹄疫等疾病的恐慌，以豬或牛為原料制備的膠原蛋白在發(fā)展應用上受到一定的限制。因此，人們尋求從其他來源得到健康綠色的膠原白，來取代動物膠原。其中，水產(chǎn)動物尤其是其加工廢棄物—皮、骨、鱗中豐富的膠原蛋白，而使其成為研究的熱點。膠原多肽是膠原或明膠經(jīng)蛋白酶等降解處理后制得的具有較高消化吸收性、分子量約為2000～30000的產(chǎn)物，不具有明膠的凝膠性能。目前市場的膠原幾乎都是膠原多肽。自1979年日本學者大島等確認明膠來源的多肽具有抑制血壓作用以來，大量研究表明膠原多肽具有多方面的生理功能。如蛋白質(zhì)消化吸收率幾乎達100%，保護胃粘膜以及抗?jié)冏饔?，抑制血壓上升作用，促進骨形成作用，促進皮膚膠原代謝等。本課題的任務即是利用酶工程技術(shù)，以資源較多鯉魚為主要的利用對象，通過選擇適宜的蛋白酶和控制酶解過程，研究開發(fā)水產(chǎn)膠原蛋白及其多肽制品，并進行相關(guān)活性試驗，尋求合適的應用領(lǐng)域，做到變廢為寶，充分利用現(xiàn)有資源，提升海洋生物資源加工的技術(shù)水平，提高水產(chǎn)品加工廠的效益，為水產(chǎn)品加工廢棄物的高值化利用開辟廣闊的前景。和國內(nèi)外研究背景目前國內(nèi)外關(guān)于魚皮膠原蛋白的研究都非?；钴S，而國內(nèi)關(guān)于魚皮膠原蛋白的研究主要集中在分離純化以及性質(zhì)的鑒定。中國海洋大學關(guān)于膠原蛋白研究較多，如從羅非魚皮，刺參中提取膠原蛋白并對其理化性質(zhì)及生物活性進行研究;其他如YanZhang從草魚魚皮中提取膠原蛋白，并對其理化性質(zhì)進行研究。國外學者如S.Morimural從畜禽和魚廢棄物中提取膠原蛋白，并對得到的膠原蛋白進行理化性質(zhì)的檢驗;另外，sitthipongNalinanon從大眼梅鯛加工產(chǎn)物魚皮中提取膠原蛋白Jin-wookWoo以黃鰭金槍魚皮加工產(chǎn)物作為原料提取膠原蛋白，并對其進行性質(zhì)鑒定研究。隨著組合生物技術(shù)等高新技術(shù)的發(fā)展，使得具有生物學功能的活性蛋白及寡聚肽的開發(fā)成為水產(chǎn)品高值化利用領(lǐng)域的研究熱點。魚皮來源的膠原蛋白由于其低抗原性、弱穩(wěn)定性而多應用于保健食品、功能飲料以及化妝品行業(yè)，而在生物醫(yī)學材料上的應用較少。目前用于生產(chǎn)生物醫(yī)學材料或臨床研究的膠原都集中來自于陸生動物。大量研究表明，低分子活性蛋白和活性多肽肽具有易消化吸收(比氨基酸更易吸收)、保護胃粘膜及抗?jié)冏饔?、抗過敏、降血壓、降膽固醇、抗衰老、促進傷口愈合、增強骨強度和預防骨質(zhì)疏松、預防關(guān)節(jié)炎、促進角膜上皮損傷的修復和促進角膜上皮細胞的生長等多種活性，給其廣泛應用帶來了光輝前景，因而國外關(guān)于活性多肽的研究極為活躍，并且已有多種哺乳動物來源的活性多肽產(chǎn)品上市。對于水產(chǎn)動物活性多肽的研究盡管十分活躍，但是還很少看到水產(chǎn)動物來源的活性多肽產(chǎn)品出現(xiàn)。三、膠原蛋白多肽的生物活性及其與分子大小的關(guān)系膠原蛋白多肽主要是ACE抑制肽、抗氧化肽、促進生長活性肽、提高人體免疫的多肽及抗腫瘤肽等。在實際應用中不同分子量的多肽具有不同的用途。Hee-Guk等通過水解阿拉斯加青鱈的魚皮，從其水解物中分離出分子量介于900～1900Da的肽片段，它具有ACE抑制因子的活性，并純化出氨基酸組成分別為Gly-Pro-Leu、Gly-Pro-Met的肽片段。Fahmi等用一種堿性蛋白酶將海鯛魚鱗膠原蛋白水解，所得肽的混合物具有ACE抑制活性，具有明顯降低血壓的作用。Joen等用超濾技術(shù)對鱈魚蛋白水解物進行分離純化，獲得3個肽片段，10-30kDa的肽片段具有優(yōu)良的乳化特性和攪打性能；分子量介于3～10kDa的肽片段，其抗氧化性能很高；而分子量<3kDa的肽片段。具有優(yōu)越的ACE抑制因子的功效。Mofimura等在研究來自漁業(yè)廢棄物的膠原蛋白時發(fā)現(xiàn)，黃尾魚的骨膠原酶解物是平均分子量為350的肽，這種多肽具有顯著的抗氧化活性和潛在的降血壓活性。四、研究主要內(nèi)容和思路1.選取產(chǎn)量鯉魚鱗為研究對象，從中提取并純化膠原蛋白，并對其理化性質(zhì)進行研究。2.利用一系列的蛋白酶水解鯉魚鱗膠原蛋白，綜合考慮水解度和活性指標，確定酶解的最佳工藝。3.膠原蛋白多肽組分對自由基的清除作用以及水解產(chǎn)物的體內(nèi)抗氧化作用。4.膠原蛋白多肽降血壓的生物活性研究。體外篩選具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性的多肽組分，并把該組分給藥于腎血管性高血壓大鼠，檢測多肽組分對高血壓大鼠的降壓作用。5.膠原蛋白多肽對B16黑素瘤細胞黑素合成的影響。體外篩選多種膠原蛋白多肽對B16黑色素瘤細胞黑素合成的影響，從中找出抑制細胞黑素合成效果最明顯的膠原多肽。五、預期結(jié)果以鯉魚鱗為原料，通過采用不同提取方法提取膠原蛋白，確定了從水產(chǎn)加工廢棄物中大量提取膠原蛋白制品的方法。通過鯉魚鱗膠原蛋白的紫外吸收測定、常規(guī)氨基酸質(zhì)量分數(shù)測定和SDS-APGE電泳分析，確定所提取的蛋白質(zhì)制品是純度較高的膠原蛋白，經(jīng)電泳測定鯉魚鱗膠原蛋白的分子量。測定了鯉魚鱗膠原蛋白的熱變性溫度。以魚皮膠原蛋白水解物對輕自由基和超氧陰離子自由基化學發(fā)光的抑制率為評價指標，確定了制備具有清除自由基活性的魚皮膠原蛋白多肽的最佳酶解工藝條件。不同分子量的膠原蛋白多肽對自由基的清除效果不同，從中選出一種抗氧化效果最明顯的膠原蛋白多肽。膠原蛋白多肽具有明顯的降血壓作用，能顯著的降低腎血管性高血壓大鼠的動脈血壓，并呈現(xiàn)劑量