熒光細胞化學樣品制備和檢測技術

熒光細胞化學樣品制備和檢測技術蔡司光學儀器11/28/20231.什么是顯微鏡熒光檢測？

一般熒光顯微鏡熒光觀察，是借標本:1）本身的熒光反應物質吸收熒光光源發(fā)出的激發(fā)光能而呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象，或2）利用組織及細胞內某成分可與熒光染料（熒光色素）結合并受到熒光激發(fā)后所出現(xiàn)特定顏色的熒光供作觀察。作出定性、定位（根據(jù)熒光圖象的形態(tài)學特征和顏色）和定量（根據(jù)熒光的亮度）。其中：1）為自發(fā)熒光，2）為繼發(fā)熒光。11/28/20232.落射熒光與透射光觀察的區(qū)別

11/28/20233.落射熒光與透射光觀察的區(qū)別

11/28/20234.什么是熒光?物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質吸收短波光，發(fā)射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光熒光的性質吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長＞激發(fā)波長（損失熱能）熒光強度極小于激發(fā)光的強度有不同程度的衰減熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率11/28/20236.熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途優(yōu)點：檢出能力高（放大作用）對細胞的刺激?。梢曰铙w染色）能進行多重染色用途：物體構造的觀察——熒光素熒光的有無、色調比較進行物質判別——抗體熒光等發(fā)熒光量的測定對物質定性、定量分析11/28/20237.標本制作的順序組織固定、取材、組織脫水、包埋、切片、染色、封片培養(yǎng)的懸浮細胞、粘附細胞11/28/20238.組織固定活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質代謝就會因物質代謝障礙產生一系列的生物化學和組織學改變，并導致形態(tài)學上可見的細胞器變化和細胞組織的形態(tài)改變直至腐敗自溶。選擇最佳固定液標準是：（1）最好地保持細胞和組織的形態(tài)結構；（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定液在免疫組化和細胞化學技術中是禁用的；（3）不要用可能帶有自發(fā)熒光的固定劑，如帶有苦味酸的固定劑，還有甲醛升汞固定液，會使上皮細胞產生非特異性熒光；（4）固定劑的選擇、固定時間、溫度和PH值都會影響實驗結果。11/28/20239.單純固定液（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能滿足常規(guī)HE及免疫組化、PCR等工作。中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對組織抗原性的保存均優(yōu)于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后應密封并保存在陰涼處，保存時間不超過一個月。甲醛（40%）100ml無水磷酸氫二鈉6.5g磷酸二氫鈉4.0g蒸餾水900ml11/28/202310.單純固定劑（2）乙醇固定液：使用時以80%-95%的濃度為宜，具有硬化、固定、脫水等作用，對組織滲透力較弱，因此很少單獨使用，但其保存組織中的核酸強于中性甲醛，故常用于有核酸操作的實驗或檢查，如果用于證明尿酸結晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定組織。（3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培養(yǎng)細胞的固定。11/28/202311.混合固定液（1）乙醇-甲醛（乙醇-福爾馬林，AF）固定液：適用于皮下組織中肥大細胞的固定。該固定液有固定兼脫水作用，固定后的標本可直接入95%乙醇脫水。甲醛（40%）100ml95%乙醇900ml（2）B5（醋酸鈉-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴組織。染色前應進行脫汞沉淀處理。無水醋酸鈉1.25g升汞6.0g蒸餾水90ml使用前加入甲醛10ml11/28/202312.混合固定液（3）Bouin固定液：特別適用于睪丸活檢組織的固定。Bouin液對組織固定較均勻，收縮很少，不會使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。飽和苦味酸水溶液（約1.22%）75ml甲醛25ml冰醋酸5ml（4）Carnoy固定液：穿透能力強，可很好的固定細胞質和細胞核，特別適用于固定外膜致密的組織，也適用于糖原及尼氏小體的固定。無水乙醇60ml氯仿30ml冰醋酸10ml11/28/202313.混合固定液（5）Zenker固定液：經此液固定的標本，細胞核和細胞質染色頗為清晰，但成本較高且需特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽光，以免引起化學變化而失效。升汞5.0g重鉻酸鉀2.5g硫酸鈉1.0g蒸餾水（加至）100ml11/28/202314.取材組織取材：按病理診斷和研究的目的和要求，從標本上切取適當大小和數(shù)目的組織塊，供后續(xù)制片和顯微鏡下觀察用于診斷以及相關研究。細胞標本的取材（1）貼壁生長的培養(yǎng)細胞（2）懸浮的培養(yǎng)細胞：沉淀涂片，細胞離心涂片器（cytospin），載玻片上涂粘附劑—多聚賴氨酸（0.01~0.5%），甲醛-明膠，鉻礬明膠，Vectabond試劑（3）體液沉淀涂片法（4）穿刺吸取涂片法（5）印片法11/28/202315.組織脫水試劑濃度／溫度時間設定中性緩沖甲醛４％３．００ｈ乙醇８０％１．００ｈ乙醇９０％１．００ｈ乙醇９５％過夜無水乙醇Ｉ２．００ｈ無水乙醇ＩＩ２．００ｈ二甲苯－無水乙醇體積比為１：１３０ｍｉｎ二甲苯Ｉ３０ｍｉｎ二甲苯ＩＩ１．００ｈ石蠟６０℃１．００ｈ石蠟６０℃１．００ｈ石蠟６０℃１．００ｈ11/28/202316.包埋組織塊經過固定、脫水、透明、浸蠟等處理后，用包埋劑（如石蠟、樹脂、塑料等）將其包制成含組織塊的蠟塊或塑料塊等的過程稱為包埋。包埋步驟先將熔化的石蠟注入包埋托內，而后用鑷子將經過浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷臺商，用鑷子輕按組織塊，以達到組織塊平整，蓋上脫水盒底，再加好石蠟，移至冷凍臺上，待冷凍好后，卸下組織蠟塊待切。包埋時應根據(jù)組織的不同，選擇大小型號合適的包埋托；有要求直立包埋的組織要用鑷子將組織固定在蠟塊中央稍停片刻，以使組織組織在蠟凝時立住，達到立埋的要求。11/28/202317.切片冰凍切片為免疫組織化學染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點是能夠比較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細胞表面抗原更應該采用冰凍切片。新鮮的組織及已經固定的組織均可作冰凍切片。冰凍切片后如果不染色，必須吹干，貯存于低溫冰箱內，或進行短暫預固定后貯存于冰箱中保存。要注意刀片等接觸陽性物質的污染問題。11/28/202318.切片石蠟切片其優(yōu)點是組織結構保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值，能連續(xù)切片（薄片），組織結構清晰，抗原定位準確。用于免疫組織化學技術的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同，主要是要在比較低的溫度下進行。①脫水、透明等過程應在4℃下進行，以盡量減少組織抗原的損失；②組織塊大小應限于2cmx1.5cmx0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸臘；③浸臘、包埋過程中，石蠟應該保持在60℃以下，以熔點低的軟臘最好（低溫石蠟包埋）；④石蠟切片應放在37℃恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，可存放于4℃冰箱內備用；⑤冷凍干燥包埋法：可以保存組織內可溶性物質，防止蛋白質變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。11/28/202319.切片振動切片

可以把新鮮組織（不固定不冰凍）切成20~100um的厚片，以漂浮法進行染色。組織不冰凍，無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，能比較好地保留組織細胞內脂溶性物質和細胞膜抗原。11/28/202320.封片封片劑常用甘油和0.5mol/LpH9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液。如需將染色后的樣品保存一段時間，可以用指甲油在蓋玻片周圍封閉。暗處保存。一般無須脫水透明以及用樹膠封片。如果必須脫水透明，封片最好用DPX。由于激光共聚焦顯微鏡觀察采集圖象很快，所以一般用PBS或生理鹽水也可以。11/28/202321.組織和細胞的自發(fā)性熒光檢測1、動物組織一般呈現(xiàn)弱淡蘭色熒光，其中彈性纖維的熒光較強；2、紅細胞血紅蛋白中的卟啉呈紅色熒光，但在正常情況下，卟啉和鐵離子相結合，鐵離子有抑制熒光作用，所以紅細胞不發(fā)熒光。如在血液中加酸使鐵離子游離，或缺鐵性貧血，紅細胞可呈紅色熒光；3、細胞內的脂褐素呈棕黃色的自發(fā)熒光，例如心肌細胞核兩側的肌漿內，隨著年齡的增長或在某些疾病的情況下，可見較大量的棕黃色脂褐素熒光顆粒；4、某些腫瘤細胞在紫外或藍光激發(fā)可呈現(xiàn)明顯的自發(fā)熒光，可作原位腫瘤的早期診斷；5、維生素A呈綠色的自發(fā)性熒光。如大鼠食入維生素A后，在肝細胞、Kuffer細胞、腎上腺束狀帶細胞、肺和腎的間質細胞、卵巢間質細胞和黃體細胞等的胞質內均可見到維生素A的綠色熒光；6、某些藥物也可呈現(xiàn)一定顏色熒光，如奎寧為綠色熒光，四環(huán)素為黃色熒光。四環(huán)素能與骨基質中的鈣結合，利用這一特性，可以用四環(huán)素飼養(yǎng)動物以觀察新骨質的形成。另外，四環(huán)素和癌細胞有較大的親合力，能在惡性腫瘤內形成黃色的熒光灶；7、有機體的單胺神經原、消化道和呼吸道粘膜內神經內分泌細胞中的內源性生物胺—兒茶酚胺、5-羥色胺和組織胺等與某些醛類物質在一定條件下可發(fā)生縮合反應而呈現(xiàn)熒光。11/28/202322.熒光組織細胞染色（熒光探針檢測，熒光標記檢測）11/28/202323.熒光染色方法浸染（組織或細胞固定在玻片上浸入染色缸，懸浮細胞在懸液中染色，再涂于玻片上），適用于染液較多，樣品在玻片上固定比較牢固，染色時間需要比較長，染色均勻。滴染（染色液直接滴在固定于玻片上的組織或細胞上），適用于染液較少，樣品在玻片上固定不是很牢固，染色時間較短。染色不易均勻，特別是時間比較長時，需添加染料。漂浮法（組織片或培養(yǎng)黏附在一些膜上的組織細胞漂浮于染液上），適用于較大較厚的組織片，或黏附在一些膜上的組織細胞，染料使用相對較少。由于樣品一般是反過來面朝下（染液面），所以特別注意不要在樣品與染液間出現(xiàn)氣泡。11/28/202324.細胞骨架F-actin（F-肌動蛋白）染色：用FITC或Rhodamine標記的Phalloidin（鬼筆環(huán)肽）。F-肌動蛋白是大多數(shù)真核細胞中以聚合絲形式存在的肌動蛋白。Phalloidin能與細胞內的F-actin特異性結合。激發(fā)光激發(fā)Phalloidin上結合的熒光標記，使F-肌動蛋白被觀察到。FITC或Rhodamine標記的Phalloidin，溶于甲醇中制成貯存液（200u/ml），染色時終濃度為5u/ml。細胞涂片→PBS洗滌→2%戊二醛固定15分鐘→PBS洗滌→0.2%TritonX-100抽提2分鐘→PBS洗滌→FITC或Rhodamine標記的Phalloidin室溫20分鐘→PBS洗滌，觀察。

11/28/202325.FluorochromesandStainsDAPI,Hoechst,SYTO16:semipermeantandpermeantDNAstain,apoptosisGFP:usedinlivingsystemsasagene/proteinreporterLuciferyellow,Fluorogold:neuronaltracerMitoFluorgreen,MitoTrackergreen:mitichondrialmarker11/28/202326.DiI:lipophilicmembranemarkerRhodamine6G,MitoTrackerred:mitochondrialandERmarkerPropidiumiodide,EthidiumBromide,SYTO25:impermeantandpermeantnucleicacidstain11/28/202327.TO-PRO-3Alexa488Alexa568HumancoloncryptChristineAnderson,LaboratoryofProf.RayWhite,HunstsmanCancerInstitute,Utah11/28/202328.細胞熒光離子探針游離鈣離子含量測定：有Fura2AM,Indo1和Fluo3AM,前兩者激發(fā)波長為紫外，而且均是雙激發(fā)波長的比率熒光，所以目前一般在熒光顯微鏡觀察，特別是激光共聚焦顯微鏡觀察中用Fluo3AM。Ex/Em:506/526。Fluo3本身不發(fā)熒光，只有當與胞漿內游離鈣離子結合后，受激發(fā)光照射才發(fā)出熒光。Fluo3AM不能與游離鈣離子結合，但它能穿過細胞膜進入細胞內（Fluo3不能透過細胞膜進入細胞），進入細胞后的Fluo3AM中的AM被細胞內非特異性酯酶水解，變?yōu)镕luo3，F(xiàn)luo3與細胞內游離鈣離子結合，發(fā)出熒光。熒光強弱直接反應了細胞內鈣離子的含量。Fluo3AM染色：Fluo3AM用DMSO配成貯存液，冰凍保存，使用時終濃度為1uM。染色一般為37℃，30~45分鐘。Fluo3染色細胞內鈣離子，可以通過時間掃描，進行細胞內鈣離子含量和分布的動態(tài)觀察。細胞內pH的測定：SNAFL：雙發(fā)射波長比率熒光。Ex:514(488),Em:580/640BCECF：雙激發(fā)波長比率熒光。Ex:490/440,Em:53011/28/202329.PhysiologyProbesIndo-1,Fura-2:dualemissionordualexcitationcalciumprobeCalciumgreen,Fluo-3:singlewavelengthcalciumprobeBCECF:singleordualexcitationwavelengthpHprobeJC-1:potentialsensitivemitochondrialdualemissionCalcein:volumechanges,gapjunctions,liposomes,permeabilityLysosensorBlueDND-192,LysoSensorGreenDND-153:lysosomalmarkerNBD-C6ceramide:GolgimarkerRhodamine-123:mitochondrialmarker11/28/202330.SNARF:pHindicatoremissionratioFM1-43,RH-414:plasmamembraneFurared:calciumindicator,decreasedfluorescenceonbindingDIC18(3),DIC16(3):ERmarkerLysoTrackerYellowDND-68:lysosomalmarkerMitoTrackerOrange,RhodamineBHexylester,Tetramethylrosamine:mitochondrialmarker11/28/202331.Mouse;hippocampalneurons;fluorescenceofGFPShigeoOkabeDepartmentofAnatomyandCellBiologyTokyoMedicalandDentalUniversity11/28/202332.免疫熒光細胞化學技術根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出熒光，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。熒光抗體法：用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法。（較常用）熒光抗原法：用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法。免疫熒光細胞化學標記的熒光素以異硫氰酸熒光素（FITC綠色熒光）、羅丹明（TRITC橙紅色熒光）、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC橙紅色熒光），Cy3（橙紅色熒光），Cy5（紅色熒光），德克薩斯紅（橙紅色熒光）較常用。11/28/202333.免疫熒光細胞化學分直接法、夾心法、間接法和補體法四種。1、直接法：1）檢查抗原法：（最早的方法）用已知的特異性抗體與熒光素結合，制成熒光特異性抗體，直接與細胞或組織中相應抗原結合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。該方法很特異和簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。2）檢查抗體法：將抗原標記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細胞或組織內相應抗體反應，而將抗體定位檢測出來。11/28/202334.2、間接法：1）檢查抗體法（夾心法）先用特異性抗原與細胞或組織內抗體反應，再用此抗原的特異性熒光抗體與結合在細胞內抗體上的抗原相結合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間。2）檢查抗體法用已知抗原細胞或組織標本的切片，加上待測血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體便沉淀結合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性IgG熒光抗體）與結合在抗原上的抗體反應（如檢測人血清中的抗體必需用抗人IgG熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。11/28/202335.3）檢查抗原法雙薄片先用特異性（對細胞或組織內抗原）抗體（或稱第一抗體）與細胞標本反應，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結合的抗體，再用間接熒光抗體（第二抗體，有種特異性）與結合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復合物。由于結合在抗原抗體復合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細胞抗原上每個分子結合3~5個分子抗體，當此抗體作為抗原時又可結合3~5個分子的熒光抗體，所以與直接法相比熒光亮度可增強3~4倍。靈敏度高，只需制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標記顯示。是目前使用得最廣泛的技術。缺點為容易出現(xiàn)非特異性染色反應。11/28/202336.3、補體法1）直接檢查組織內免疫復合物法用抗補體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結合在抗原抗體復合物上的補體反應，而形成抗原抗體補體復合物—抗補體熒光抗體復合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復合物存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢等。2）間接檢查組織內抗原法常將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標本切片上，經37℃孵育后，如發(fā)生抗原補體抗體反應，補體就結合在此復合物上，再用抗補體熒光抗體與結合的補體反應，形成抗原抗體—抗補體熒光抗體的復合物。此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標記顯示。缺點為容易出現(xiàn)非特異性染色反應。11/28/202337.4、雙（多）重免疫熒光標記法在同一細胞組織標本上需同時檢查兩種或兩種以上抗原時，要進行雙（多）重熒光染色。一般均采用直接法。將這些熒光抗體（如抗A和抗B）以適當比例混合，加在標本上（也可分別加），孵育后，按直接法洗去未結合的熒光抗體。不同熒光標記抗體最好用波長范圍分得比較開的熒光素。如綠色與紅色搭配。11/28/202338.11/28/202339.研究中常用熒光染料和探針細胞表面抗原、胞內某種蛋白免役熒光標記：與抗體耦聯(lián),直標:一抗+熒光探針間標:二抗+熒光探針如:微管蛋白tublin(抗tublin抗體+熒光探針)肌動蛋白actin(Palloidine+熒光探針)1．染色切片經固定后，滴加經稀釋至染色效價的熒光抗體，在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內，防止干燥。

2．洗片傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結晶。3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢

11/28/202340.研究中常用熒光染料和探針細胞膜表面受體 配體+熒光探針如:nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)標記Gm1:霍亂毒素受體霍亂毒素+FITC1.切片固定后用毛細滴管吸取經適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/lpH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。

2.再滴加間接熒光抗體，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

11/28/202341.研究中常用熒光染料和探針1.Amine-ReactiveProbes與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等

Green

Red

Fura-red

FITC494/518TRITC544/572Cy5650/690(異硫氰基熒光素)(四甲基異硫氰基羅丹明)AlexaFluor488488/530PE565/578(藻紅蛋白)TexasRed595/615(德州紅)Cy3558/568BODIPYFL503/512BODIPYTMR543/569BODIPYTR592/618

11/28/202342.研究中常用熒光染料和探針2.標記細胞器熒光探針1)線粒體MitochondriaRodamin123505/534，可染活細胞，陽離子,可檢測線粒體膜電位,且在多數(shù)細胞中停留時間短JC1線粒體膜電位低時為單體490/527發(fā)綠光線粒體膜電位高時為多聚體490/590發(fā)紅光可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針MitotrackerGreenFM490/516,染活細胞或固定細胞, 穩(wěn)定不漏出MitotrackerOrangeCMTMRos551/576,(氧化型)MitotrackerOrange還原型,只能染活細胞11/28/202343.研究中常用熒光染料和探針2)溶酶體

Lysosome

中性紅541/640:微偏堿性,可標記溶酶體等酸性器官

為非特異性AO:LysoTrackerGreenDND-26504/511,染活細胞LysoTrackerBlueLysoTrackerRed3)內質網EndoplasmicReticulumDiOC6484/500:非特異性,較高濃度標記內質網,較低濃度標記線粒體4)高爾基體GolgiapparatusNBDC6-ceramie466/536,可染活或死細胞11/28/202344.研究中常用熒光染料和探針

細胞器的單克隆抗體5)細胞核PIpropidiumiodide536/617DNA/\RNA死細胞碘化丙啶EBethidiumbromide518/61