放免的方法的設(shè)計(jì)

放射免疫學(xué)放射免疫分析方法的設(shè)計(jì)臨床免疫教研室李雪前言原理4

，驚?放射免疫方法的建立原則根據(jù)分析目的和要求，通過對(duì)標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品（校準(zhǔn)品）的合理匹配，以及對(duì)反應(yīng)條件、分離方法的選擇，達(dá)到最滿意的效果放射免疫設(shè)計(jì)的目標(biāo)根據(jù)要求使試劑的劑量反應(yīng)曲線在滿足靈敏度的情況下，是多數(shù)樣品得到較高的精密度?！鲮`敏度的設(shè)計(jì)■反應(yīng)的選擇■反應(yīng)方式的選擇■分離方法的選擇■方法學(xué)鑒定靈敏度的設(shè)計(jì)Sensitivity■指能測(cè)出的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的最小值，通常指“0”標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率減兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的相應(yīng)劑量?！龇派涿庖叻治龅撵`敏度靈敏度的設(shè)計(jì)Figure2,Determineworkingrangeofassay.Sensitivity■若以能測(cè)出的具有一定精密度的最小值為靈敏度的定義，則應(yīng)根據(jù)劑量反應(yīng)曲線的精密度圖（PDP），以CV%_10%的最小劑量為有效地可測(cè)量的最小劑量，即靈敏度，靈敏度的設(shè)計(jì)______■放射免疫分析的靈敏度Sensitivity?影響因素-標(biāo)記物的比活性-抗體的親和力和用量-劑量反應(yīng)曲線濃度范圍標(biāo)記物的用量__________適當(dāng)比活性？穩(wěn)定的標(biāo)記物會(huì)靈敏度t減少樣品化學(xué)量統(tǒng)計(jì)漲落計(jì)數(shù)誤差\樣品保持一定的計(jì)數(shù)率①I標(biāo)記物的用量OC計(jì)數(shù)率標(biāo)記物的用量■最佳標(biāo)記抗原的選擇方法用不同濃度的標(biāo)記抗原作一系列的抗血清實(shí)驗(yàn)，直到標(biāo)記物減少不再使曲線再右移，此時(shí)標(biāo)記物濃度稱“減弱濃度”，即為加入標(biāo)記抗原化學(xué)量的最4氏濃度?？寡宓挠昧縚___9放射免疫分析抗血清的鑒定指標(biāo)■高親和力■高滴度■高特異性知抗血清的用量■確定抗血清用量的方法抗血清的用量■確定抗血清用量的方法-抗血清滴度曲線結(jié)合率為B/T807030%-50%的抗血60清稀釋度5040302010010001（的G1DOOOAntlJx>dyDilutionFactor’MJtlfl1UEW抗血清的用量■確定抗血清用量的方法-做兩條抗體稀釋度曲線A.單純標(biāo)記抗原B.標(biāo)記抗原中加入微量非標(biāo)記抗原兩條曲線分離度最大時(shí)抗體稀釋度，即為最佳稀釋度-考慮了標(biāo)記抗原與抗原免疫活性是否一致劑量反應(yīng)曲線_____■劑量反應(yīng)曲線的濃度范圍_可影響反應(yīng)曲線的斜率-根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系的要求以及稀釋曲線確定劑量反應(yīng)曲線_____■劑量反應(yīng)曲線的濃度范圍-可影響反應(yīng)曲線的斜率-根椐實(shí)驗(yàn)體系的要求以及稀釋曲線確定-最低標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)與標(biāo)記物的用量接近，B/Bo=8O-9O%-最大濃度劑量點(diǎn)的結(jié)合率為10-20%-待測(cè)物的正常濃度范圍應(yīng)在劑量反應(yīng)曲線的直線部分itm待測(cè)物濃度較高提高靈敏度靈敏度低所需抗體用多劑量反應(yīng)曲線■劑量反應(yīng)曲線的濃度范圍待測(cè)物濃度較低少小量圍用范體量抗劑劑量反應(yīng)曲線■劑量反應(yīng)曲線的工作范圍-工作范圍由PDP3確定-工作范圍與劑量反應(yīng)曲線的濃度范圍是兩個(gè)不同的概念1?m

1__劑量反應(yīng)曲線■劑量反應(yīng)曲線的工作范圍'工作范圍確定方法:A.CV%<10%的劑量區(qū)段為有效工作范圍Figure2,Determineworkingrangeofassay.劑量反應(yīng)曲線JOman為劑量反應(yīng)曲線接近直線的部分，待測(cè)物的正常范圍應(yīng)在該區(qū)段以內(nèi)?！鰟┝糠磻?yīng)曲線的工作范圍-工作范圍確定方法：B.結(jié)合率（B/Bo%）在20-80%之間的區(qū)段為工作范圍#00>騙反應(yīng)試劑劑量關(guān)系■一般規(guī)律抗血清減少斜率增加標(biāo)記物減少低劑量樣品靈敏度/測(cè)定敏感加||\高劑量區(qū)變平，高值測(cè)定不準(zhǔn)工作范圍減小反應(yīng)試劑劑量關(guān)系■一般規(guī)律血清增加標(biāo)記物增加斜率降低工較大圍作范靈敏度低劑量區(qū)變平，測(cè)定不準(zhǔn)下洚X適于高值樣品測(cè)定■比較抗原濃度和抗體濃度的最佳匹配反應(yīng)試劑劑量關(guān)系-數(shù)學(xué)模型推倒最適抗體濃度q=3/K最適標(biāo)記抗原濃度*Ag=4/K-經(jīng)驗(yàn)確定（常用于實(shí)際工作）①通過一定量的標(biāo)記抗原作抗體滴度試驗(yàn)，確定抗血清稀釋度②通過劑量反應(yīng)曲線的制作進(jìn)行逐步調(diào)整，最后達(dá)其最佳相互關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)品一^―-_■標(biāo)準(zhǔn)配的制備-標(biāo)準(zhǔn)品介質(zhì)系統(tǒng)應(yīng)與待測(cè)樣品一致或近似如，待測(cè)為血清樣本，最好用零值血清制備標(biāo)準(zhǔn)品-若用緩沖液制備標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)加入一定量的蛋白質(zhì)（1-2X的BSA）或明膠反應(yīng)條件的選擇反應(yīng)條件的選擇_____?緩沖體系■添加劑■反應(yīng)體積■溫育條件■樣品處理緩沖體系■特異性結(jié)合反應(yīng)的親和常數(shù)受反應(yīng)介質(zhì)的pH和離子強(qiáng)度的影響pH?Ag-Ab易在酸/強(qiáng)堿中解離?最適pH:7.0-8?6離子強(qiáng)度?離子強(qiáng)度過低，易引起反應(yīng)溶液pH改變-離子強(qiáng)度過高，使Ab與Ag的結(jié)合率下降?最適離子強(qiáng)度仏05-0.1M/L緩沖體系■常見的緩沖體系-磷酸鹽緩沖液(PBS)-巴比妥緩沖液-乙酸鹽緩沖液-硼酸鹽緩沖液-Tris-HCl緩沖液添加劑_____■目的：改善試劑的穩(wěn)定性/特殊需要■要求：對(duì)特異性結(jié)合無影響■常見添加劑EDTA-Na2-ANS-BSA/明膠-抑肽酶-i氮納/硫柳汞反應(yīng)體積■抗原抗體反應(yīng)反應(yīng)物濃度-減小反應(yīng)體積，利于提高反應(yīng)濃度，提高實(shí)驗(yàn)靈敏度-體積過小，易出現(xiàn)加樣誤差，形成放射性復(fù)合物的量亦減少，測(cè)量誤差增加常規(guī)選用反應(yīng)體積為：0.3ml?1.2ml溫育條件■反應(yīng)的平衡常數(shù)與溫度相關(guān)-嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度，包括整個(gè)分析至離心過程-測(cè)定指標(biāo)不同，其對(duì)溫度的依賴程度亦不同■溫度與反應(yīng)速度相關(guān)-提高反應(yīng)溫度，可加速反應(yīng)，但親和力下降-4"C抗體親和力最大，但反應(yīng)時(shí)間較長目前多采用較短時(shí)間37"C或室溫孵育樣品處理__樣品中可能存在各種干擾物質(zhì)，或影響特異性反應(yīng)的物質(zhì)。故許多分析系統(tǒng)需要對(duì)分析樣品進(jìn)行預(yù)處理，常用的預(yù)處理方法是稀釋或提取。反應(yīng)方式的選擇反應(yīng)方式______■平衡法■順序飽和法■即時(shí)法反應(yīng)方式■平衡法加入分離劑方法學(xué)評(píng)價(jià)穩(wěn)定、重復(fù)性好、劑量反應(yīng)曲線具有競(jìng)爭(zhēng)性分析的典型特征，靈敏度相對(duì)較低反應(yīng)方式■順序飽和法（非平衡競(jìng)爭(zhēng)體系）AgAb1

平衡郇|終止AbAg反應(yīng)Ag*Ag*Ab方法學(xué)評(píng)價(jià)靈敏度較高，但因第二次孵育時(shí)間較短，要求標(biāo)記抗原的比活性較高，并且要求分離方法更為精細(xì)。因存在兩次溫育，曲線偏離典型特征，且反應(yīng)穩(wěn)定性較差，反應(yīng)方式____■即時(shí)法在反應(yīng)尚未達(dá)完全平衡時(shí)終止反應(yīng)，并進(jìn)行分離測(cè)定。要求：需嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間。分離方法的選擇分離系統(tǒng)_____分離系統(tǒng)應(yīng)依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇。其對(duì)放射免疫分析的結(jié)果影響較大，分離不全或錯(cuò)分都可造成劑量反應(yīng)曲線異常。不同分離方法NSB差異較大，亦可影響反應(yīng)的靈敏度，因此，選擇適宜的分離系統(tǒng)更是建立放射免疫系統(tǒng)的重要步驟之一。分離系統(tǒng)____■常用的分離體系^1251雙抗體-PEG/固相分離法>^H活性炭吸附法Flylikeabutterft^方法學(xué)鑒定___?劑量反應(yīng)曲線穩(wěn)定性檢查?靈敏度檢查方法學(xué)鑒定?精密度檢查■健全性檢查?正常參考范圍確定■臨床有效性檢查方法學(xué)鑒定___?劑量反應(yīng)曲線穩(wěn)定性檢查>NSB/T>BO/T>截距/斜率>ED^PDP圖___?劑量反應(yīng)曲線穩(wěn)定性檢查?靈敏度檢查方法學(xué)鑒定?精密度檢查■健全性檢查?正常參考范圍確定■臨床有效性檢查下面是某實(shí)驗(yàn)室10批內(nèi)部質(zhì)S控制的測(cè)量結(jié)果，根椐這些數(shù)據(jù)繪制質(zhì)控圖并說明哪些不精密整批實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)舍棄，根據(jù)是什么？QCXSD12345678910L3.310.253.203.523.563.113.282.503.03.403.523.0M10.51.2511.710.611.511.110.39.6010.6議7.908.70H30.82.7129.826.232.134.231.532.128.731.624.926.2樣品4.58.815.354.115.66.90.311.221.920.610.018.2LOW3.