SDS凝膠電泳操作手冊(cè)

各項(xiàng)檢驗(yàn)操作留意事項(xiàng)一.SDS-操作及留意事項(xiàng)制膠按如下配方制備分別膠和濃縮膠4%濃縮膠〔3ml〕 10%分別膠〔4ml〕AB-30.25mLAB-30.25mLAB-60.8mL3×gelbuffer0.75mL1.335mL50%甘油(v/v)0.64mLHO2mL1.235mL10%APS(w/v)22.5uL20uLTEMED2.25Ul2uL留意事項(xiàng)：配制前先將兩塊玻璃板夾緊，可以先試漏。首先配置分別膠，用水封，靜置40min后，將水吸干，再注入濃縮膠，插上梳子，留意要避開(kāi)梳孔消滅氣泡。在參加APS〔10%過(guò)硫酸銨〕和TENED后要盡快將膠注入，防止其凝固后無(wú)法注入玻璃板內(nèi)。電泳留意事項(xiàng)：40uL10uL5×SDSPEGEloadingbuffer10min〔電磁爐1000，制好的樣放至室溫后，放℃保存，待電泳。電泳：在電泳槽底部參加陽(yáng)極緩沖液，將制好的膠連同裝置放入電泳槽中，在兩塊2uLMarker5uL樣品緩慢注入膠孔中，調(diào)整電壓800-100V。待溴酚藍(lán)從濃縮膠進(jìn)入分別膠后，電壓加至120-155V。連續(xù)電泳直到溴酚藍(lán)抵達(dá)分別膠底部，斷開(kāi)電源。留神撬開(kāi)玻璃板，除去濃縮膠，取出分別膠，參加R25040min，再用脫色液脫色。溶液的配制：正極緩沖液Anodebuffer(1×)：12.114gTris加少量ddHO溶解后，用HCL調(diào)PH至28.9500mL，4℃保存。負(fù)極緩沖液Cathodebuffer(1×)：6.057gTris+8.96gTricine+0.5SDS參加少量ddHO2溶解后，定容至500mL，4℃保存。凝膠緩沖液Gelbuffer(3×)：36.342gTris+0.3gSDSddHO100mL，HCL2調(diào)PH=8.454℃保存。AB-3：24gAcrylamide+0.75gBis-acrylamideddH保存。

O50mL4℃2AB-6：23.25gAcrylamide+1.5gBis-acrylamideddHO50mL，過(guò)濾4℃2保存?！?〕5×SDSLoadingbuffer：分別取1.25mL1MTris-HCL(PH6.8)，0.5Gsds,25mg2.5mL5mL。注：Loading使用前參加巰基乙醇，1mL溶液加100uL巰基乙醇，室溫下保存。脫色液：水：甲醇：冰醋酸=5:4:1APS：10%過(guò)硫酸銨R250考馬斯亮藍(lán)：500ml甲醇+400ml純水+100ml2.5g考馬斯亮藍(lán)二.BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定操作步驟：uL12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度〔ug/mL〕BSA〔500ug/mL〕PBS 1×將標(biāo)準(zhǔn)蛋白〔1mg/mL〕稀釋成500ug/mL。在酶標(biāo)板上取8孔，按如下參加溶液。將待測(cè)樣品稀釋到適合的濃度，加20uLuL12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度〔ug/mL〕BSA〔500ug/mL〕PBS 1×50040030020010050250201612842100481216181920三．Bradford法蛋白濃度測(cè)定操作步驟：在酶標(biāo)板上取820uL在酶標(biāo)空中，設(shè)重復(fù)。再每孔參加200uLBradford10min。在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔A595值。使用excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出待測(cè)樣品濃度。uL123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度0100150200250300〔ug/mL〕BSA〔500ug/mL〕023456H2O201817161514三.ELISA法測(cè)定EGF濃度操