松材線蟲和擬松材線蟲的生物學(xué)特性比較

松材線蟲和擬松材線蟲的生物學(xué)特性比較

在死樹中，普通松葉跳蚤和假松葉跳蚤（b）。它們時而混生,時而單獨出現(xiàn)。其致病力已被很多學(xué)者作了結(jié)論,前者是松樹致死的主要原因,后者僅有微弱的致病力。通過致病力、生理生化實驗數(shù)據(jù)比較,加之形態(tài)學(xué)上的差異,和雜交不能產(chǎn)生后代的試驗,均證明各是1個不同的種。但近來國外越來越多的學(xué)者報道上述2種線蟲存在中間類型、美國的上述兩種線蟲可以雜交成功,法國的松材線蟲與日本的松材線蟲或擬松材線蟲可以雜交成功,認(rèn)為兩者同是1個種,是種內(nèi)致病性的變異;但也有雜交不成功的報道。作者就上述2種線蟲的重要形態(tài)、酯酶帶數(shù)及遷移率、脂肪酸的組分等進(jìn)行比較,并作雜交試驗,探索我國這兩種線蟲之間的關(guān)系。一、純培養(yǎng)物的試驗1989年6月從死亡的黑松分離并得到上述兩種線蟲的純培養(yǎng)物供以下試驗。單異活體培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為PDA,飼料真菌是松梢枯病菌(Sphaeropsissapinea)。(一)交合傘觀察下的掃碼分別測量兩種線蟲的尾尖突長度、計算具尾尖突的比例、觀察尾部形狀和雄蟲交合傘形狀。在觀察雄蟲交合傘時,無論使用化學(xué)藥劑或熱力殺死的雄成蟲,尾端均呈鉤狀,欲使其腹部向上觀察交合傘幾乎不可能。為了從腹面觀察交合傘,只能用活材料,以清水作浮載劑制成臨時玻片。觀察前用吸水紙吸去坡片上的水,直至線蟲不能活動,然后輕輕推動蓋玻片。由于蓋玻片的移動,線蟲便象被搓的繩子呈一直條狀。在眾多的雄蟲中尋找腹部向上者,即交合傘展開者。這時的雄蟲交合傘清晰可見,便于顯微攝影。(二)接種松材線蟲及接種2齡線蟲在W.R.尼克爾的標(biāo)準(zhǔn)的交配技術(shù)基礎(chǔ)上作了修正。1989年12月,選用長10cm、內(nèi)徑0.7cm的小指形管,內(nèi)裝3mlPDA培養(yǎng)基。滅菌后,在圓段面上接松梢枯病菌。待菌絲長滿段面,接種2齡線蟲各1條。共3種處理:(1)每管內(nèi)接種2條松材線蟲,共51管;(2)每管內(nèi)接種2條擬松材線蟲,共45管;(3)每管內(nèi)接1條松材線蟲1條擬松材線蟲,共44管。半月后和1月后檢查線蟲數(shù)量。(三)同工酶電泳1.投資研磨法上述兩種線蟲分別培養(yǎng)在長滿松梢枯病菌的PDA平面上,半月后,清水洗下線蟲,1500轉(zhuǎn)/min離心5min,棄上清液,得到濃度極大的線蟲水懸液。加純甘油、水浴研磨后,經(jīng)8000轉(zhuǎn)/min,20min離心。取上清液備用。2.硬橡膠電泳采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳。凝膠濃度10%,pH8.7。電泳時電壓200V,電流5mA,電泳時間1小時55分。3.蘭rr-電泳有序電泳法20mg醋酸-β-萘酯,溶于20ml丙酮,加20ml0.1mol、(pH6.7)磷酸緩沖液、再加20mg堅牢蘭RR。將電泳后的凝膠放入上述溶液中37℃保溫15min即顯出酯酶譜帶。計算Rf值。(四)脂肪酸組分析1.松材線蟲干樣兩種線蟲分別作松梢枯病菌的單異活體人工繁殖。兩周后洗下線蟲,離心,烘干。得松材線蟲干樣0.0823g,擬松材線蟲干樣0.0711g。樣品經(jīng)苛性鉀/甲醇皂化。除去不皂化物質(zhì)后,皂化物經(jīng)甲酯化處理(BF3/甲醇法),作氣相色譜分析。2.測量條件儀器用島津GC-9A,OV-101玻璃毛細(xì)管柱25m,程序升溫,N2為載氣,進(jìn)樣溫度290℃。無分餾進(jìn)樣。3.新型finn空間根據(jù)質(zhì)譜分析儀(GC-MS)。質(zhì)譜條件:FINNIGAN4021色一質(zhì)聯(lián)用儀;電子轟擊源(EI),掃描范圍35—650,電子能量70eV。二、結(jié)果(一)尾尖突-易突比例兩種線蟲雌成蟲的尾部形狀、尾尖突的長度和具尾尖突的比例,均與過去的報道一致。松材線蟲雄蟲交合傘為卵圓形,擬松材線蟲的是平截形或稱平口鏟形,如圖1。(二)擬松材線蟲的指形管(1)51管接2條松材線蟲的指形管,有17管出現(xiàn)大量線蟲,比例占33.33%;(2)45管各接2條擬松材線蟲的指形管,有12管內(nèi)有大量線蟲,所占比例為26.66%;(3)44管每管接1條松材線蟲和1條擬松材線蟲,半月后有些可見到1—2條成蟲,再經(jīng)半月則無1管可以見到任何線蟲存在。(三)同工酶電泳松材線蟲酯酶譜帶有3條,遷移率分別為0.42、0.45、0.49;擬松材線蟲只有1條段帶,遷移率為0.65。見圖2。(四)內(nèi)稱化合物催化劑圖3中(a)和(b)分別為松材線蟲和擬松材線蟲的脂肪酸氣相色譜測定結(jié)果,3次重復(fù)均較一致。圖中1為十五烷酸,2為十六烷酸(棕櫚酸)、3為十七烷酸(內(nèi)稱化合物)、4和5分別為十八烯酸(亞油酸)和十八烯酸(油酸)、6為十八烷酸(硬脂酸)、7為廿烷酸(花生酸)。各成分的含量由內(nèi)標(biāo)法計算,結(jié)果如表所示。從表1可知,松材線蟲與擬松材線蟲的脂肪酸種類雖相同,但脂肪酸總量有差異,特別是某些脂肪酸有3倍多的差異,如十五烷酸松材線蟲明顯比擬松材線蟲多;而花生酸又明顯比擬松材線蟲少近3倍。三、電泳和脂肪酸分析的研究是為2個種的鑒定提供了依據(jù)從致病力、形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)試驗結(jié)果來看,供試的兩種重要的松樹線蟲之間有極明顯的差異,表明二者為不同的種;而不應(yīng)屬于同一種之間的不同致病變異。低等動物分種的重要依據(jù)是生殖器官的構(gòu)造,這決定了種間能不能交配成功產(chǎn)生后代。本文從交合傘形狀和雜交不成功證實二者應(yīng)屬于不同種。盡管尾部形狀,尾尖突大小有中間類型,而交合傘形狀應(yīng)是區(qū)分這兩種線蟲的重要形態(tài)特征。酯酶同工酶譜帶數(shù)和遷移率亦被公認(rèn)為生物分種的重要手段。這一結(jié)果也支持了它們應(yīng)為2個種的結(jié)論。脂肪酸的組分分析用于種的鑒定是一種嘗試,結(jié)果也表明二者有明顯的差異,亦可作為分種的手段。作者在應(yīng)用W.R.尼克爾的標(biāo)準(zhǔn)交配技術(shù)的過程中發(fā)現(xiàn),在一個培養(yǎng)皿內(nèi)放2條線蟲會出現(xiàn)由于范圍太大,造成老死都無機(jī)會相遇的困難,甚至在1個試管斜面上也會出現(xiàn)這種情況。改進(jìn)的結(jié)果可保證2條線蟲在直徑0.7cm的圓面積內(nèi)相遇。選用2齡幼蟲可避免用接近成熟幼蟲與成蟲混淆的可能性,保證了試驗的可靠性。試驗中用了各自幼蟲作對照,每處理都可能出現(xiàn)3種情況:(1)發(fā)育后2條都是雄蟲;(2)發(fā)育后2條都是雌蟲;(3)發(fā)育后1雌1雄。試驗在足夠多的重復(fù)下,1個試管內(nèi)放的是同1種線蟲的處理均應(yīng)在1/3的試管內(nèi)出現(xiàn)1雌1雄,從而產(chǎn)生大量后代線蟲。結(jié)果在純松材線蟲或純擬松材線蟲的組合中均近1/3的試管內(nèi)出現(xiàn)大量線蟲。如果2種線蟲能交配,第三種處理亦應(yīng)有1/3的試管內(nèi)出現(xiàn)雜交后代;然而沒有1管見到有大量線蟲存在。表明此種試驗設(shè)計結(jié)果是可靠的。電泳、脂肪酸分析的樣品線蟲是在具松梢枯病菌的PDA培養(yǎng)而成。這種真菌在無光、弱光條件下決不產(chǎn)生孢子。因為這兩種線蟲不取食真菌孢子,且孢子比重與線蟲相近,離心亦難除去,會嚴(yán)重影響電泳和脂肪酸分