臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)-課件-第16章-細(xì)胞因子與細(xì)胞粘附因子的測(cè)定52

第十六章

細(xì)胞因子與黏附分子的檢測(cè)

目

錄

一、概述

二、臨床常用測(cè)定方法

三、細(xì)胞因子與細(xì)胞黏附分子測(cè)定的臨床應(yīng)用

第一節(jié)

概

述

一、細(xì)胞因子（cytokine）

細(xì)胞因子的定義：

?活化的免疫細(xì)胞及某些基質(zhì)細(xì)胞所分泌的;?小分子糖蛋白（8~30kD）;?大多單體、少數(shù)雙聚體或三聚體

?結(jié)合細(xì)胞表面相應(yīng)受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)；

?介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞因子的分類(lèi)：

?淋巴因子（lymphokine）：淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的因子；

?單核因子（monokine）：?jiǎn)魏思?xì)胞產(chǎn)生的因子；

?集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)：刺激骨髓干細(xì)胞成熟的因子，如GM-CSF、M-CSF、EPO等；

?白介素（interleukin，IL）：白細(xì)胞間相互作用的因子，如IL-1~IL-38；

?腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)，

如TNF-α、TNF-β；

?干擾素(interferon,IFN)，如IFN-α、IFN-β和IFN-γ。

一、細(xì)胞因子（cytokine）

（一）細(xì)胞因子的共同特性與作用方式

自分泌（autocrine)：

旁分泌（paracrine)：

內(nèi)分泌（endocrine)：

作用于分泌自身的細(xì)胞，是腫瘤細(xì)胞自律生長(zhǎng)的重要機(jī)制。如白血病細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6。

作用于臨近的細(xì)胞，細(xì)胞因子血清濃度低，常規(guī)方法難檢測(cè)。如DC細(xì)胞產(chǎn)生IL-12，作用于T細(xì)胞。

即激素作用方式，通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)，作用遠(yuǎn)處的靶器官，引起全身效應(yīng)。有較高的血清濃度，如TNF

自分泌autocrine

內(nèi)分泌endocrine血液循環(huán)

遠(yuǎn)距離作用

旁分泌paracrine作用于比鄰細(xì)胞

作用于分泌細(xì)胞自身

細(xì)胞因子分泌的方式

（二）細(xì)胞因子的作用特點(diǎn)

多效性（pleiotropism）

?一種細(xì)胞因子可由不同的細(xì)胞在不同的條件下產(chǎn)生；

?一種細(xì)胞因子可作用多種靶細(xì)胞；

肥大細(xì)胞

胸腺細(xì)胞

BIL-4活化、增殖、分化

增殖

增殖

重疊性（redundancy）

?幾種不同的細(xì)胞因子作用于同一靶細(xì)胞，產(chǎn)生相同或相似的生物學(xué)效應(yīng)；

IL-2、

IL-4、

IL-5均有刺激B細(xì)胞增殖的功能

B協(xié)同性（synergy）

?一種細(xì)胞因子可增強(qiáng)另一種細(xì)胞因子的功能；

IL-4+IL-5提高誘導(dǎo)IgE類(lèi)別轉(zhuǎn)換

B拮抗性（antagonism）

?一種細(xì)胞因子可抑制另一種細(xì)胞因子的功能；

IL-4IFN-γ阻斷IL-4誘導(dǎo)IgE類(lèi)別轉(zhuǎn)換

BIFN-g網(wǎng)絡(luò)性——細(xì)胞因子以網(wǎng)絡(luò)的形式發(fā)揮作用

Th2

Th1IL-4

Th0IL-4、IL-5、IL-6、IL-10

BIFN-γ

殺傷細(xì)胞內(nèi)感染的病原菌

抗體

IL-2、IFN-γ、TNF-α

.巨噬細(xì)胞

CTL殺傷感染或突變細(xì)胞

IL-3、GM-CSF造血細(xì)胞

白細(xì)胞

DC（三）細(xì)胞因子受體的共同特征與作用方式

?細(xì)胞因子受體：通常存在細(xì)胞表面，跨膜蛋白，細(xì)胞因子名稱(chēng)后面加R表示，如IL-1R（IL-1受體）。

?細(xì)胞因子受體結(jié)構(gòu)

?胞外區(qū)：含重復(fù)結(jié)構(gòu)，識(shí)別結(jié)合細(xì)胞因子的部位；

?跨膜區(qū)

?胞內(nèi)區(qū)：?jiǎn)?dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；

?細(xì)胞因子受體的類(lèi)型

?免疫球蛋白受體家族（IgR-F)；

?細(xì)胞因子受體家族（CkR-F)，造血因子受體家族

?干擾素受體家族（IFNR-F)?腫瘤壞死因子家族（TNFR-F)?七次跨膜受體家族（STSR-F)?蛋白酪氨酸激酶受體家族（PTKR-F)（三）細(xì)胞因子受體的共同特征與作用方式

七次跨膜受體家族

干擾素受體家族

免疫球蛋白受體家族

IL-1IL-18TNF-α、TNF-β、CD40等

細(xì)胞因子對(duì)Th細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用

（四）T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子功能

胞內(nèi)病原體

普通細(xì)菌等

（四）T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子功能

1.介導(dǎo)細(xì)胞免疫的Th1細(xì)胞因子

2.介導(dǎo)體液免疫的Th2型細(xì)胞因子

3.介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制效應(yīng)的Th3型細(xì)胞因子

4.介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17型細(xì)胞因子

1.介導(dǎo)細(xì)胞免疫的Th1細(xì)胞因子

?主要分泌IFN-γ、TNF-β和IL-2?IFN-γ：由激活的CD4+T、CD8+T及NK細(xì)胞產(chǎn)生。且受IL-12和18的調(diào)控，抗感染作用。

?IL-12：誘導(dǎo)Th0分化為T(mén)h1，是連接早期天然免疫和獲得性免疫的橋梁。

?IL-18：多向調(diào)節(jié)性，抗腫瘤強(qiáng)、促進(jìn)炎癥因子

?IL-2：是引起T細(xì)胞增殖的主要因子。

?IL-4和IL-5；參與B細(xì)胞活化、增殖和成熟，參與體液免疫應(yīng)答。

?其他細(xì)胞因子或受體：IL-4R、IL-10、IL-13、IL-13RA1、IL-13RA3、IL-1R1、IL-1R2等。

2.介導(dǎo)體液免疫的Th2型細(xì)胞因子

?TGF-β

?多功能細(xì)胞因子；

?在免疫調(diào)節(jié)、造血、腫瘤免疫、炎癥反應(yīng)起作用。

?IL-10家族

?由IL-10、19、20、22、24及26組成，功能各異。

?

IL-10是公認(rèn)的免疫抑制的細(xì)胞因子，抑制Th1細(xì)胞的應(yīng)答、巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能及NK細(xì)胞的活性。

?抗炎癥作用，可應(yīng)用臨床（治療T細(xì)胞功能紊亂的免疫疾?。?/p>

3.介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)和抑制效應(yīng)的Th3細(xì)胞因子

?IL-17?由Th17細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌的促炎性因子；

?在抗腫瘤、炎性疾病如肺部疾病、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、器官移植等發(fā)揮作用。

?TNF?固有免疫主要細(xì)胞因子；

?特異性免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)間的重要連接紐帶；

?刺激白細(xì)胞黏附，刺激趨化因子的產(chǎn)生，殺死病原體，參與組織修復(fù)、血管形成等

4.介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17細(xì)胞因子

二、細(xì)胞黏附分子（cell-adhesionmolecules）

?由細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的分子；

?位于細(xì)胞表面或可溶形式；

?以配體-受體相結(jié)合的形式發(fā)揮作用；

?介導(dǎo)黏附；

?參與細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞伸展和移動(dòng)、增殖與分化。

（一）細(xì)胞表面黏附分子特性

?本質(zhì)：跨膜糖蛋白，

?組成：

?胞外區(qū)：識(shí)別配體

?跨膜區(qū)

?胞內(nèi)區(qū)：細(xì)胞骨架成分直接或間接的相連，以激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

?種類(lèi)：整合素、選擇素超家族、Ig超家族、可溶性黏附分子和鈣黏素家族等

（二）黏附分子的主要生物學(xué)功能

?參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞的伸展和移動(dòng)、細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化；

?促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活化、增殖、分化或免疫殺傷作用；

?參與炎癥過(guò)程中白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附和滲出。

（三）黏附分子與炎性疾病

1.黏附分子與動(dòng)脈粥樣硬化

?ICAM與P-選擇素顯著增高，可募集單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的聚集和侵入，在已有損傷條件下，加重?fù)p傷，VCAM在動(dòng)脈損傷的后期階段起重要作用。

2.黏附分子與腎臟疾病

?ICAM是腎臟炎癥的主要標(biāo)志之一；

?在急性腎衰中，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，ICAM-1表達(dá)明顯增加；

?慢性梗阻性腎病患者，ICAM-1持續(xù)表達(dá)可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的激活或持續(xù)浸潤(rùn)，導(dǎo)致腎小管細(xì)胞的損傷。

單核巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用

PeterLibby,Nature,20023.黏附分子與肝臟疾病

?在肝纖維化，整聯(lián)素表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟組織的沉積，啟動(dòng)肝纖維化。

?慢性病毒肝炎血清中E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1、IL-1等水平增高。

?酒精肝硬化ICAM-1明顯增加，肝移植，P-選擇素濃度明顯增高,是血栓標(biāo)志物。

4.黏附分子與自身免疫性疾病

?SLE:皮膚損傷部位、及其他部位的E-選擇素、VCAM-1和ICAM-1表達(dá)明顯高于正常人。

?類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中發(fā)現(xiàn)E-選擇素的高表達(dá)。

（三）黏附分子與炎性疾病

第二節(jié)

臨床常用的測(cè)定方法

常用測(cè)定方法

基因水平

蛋白水平

?mRNA表達(dá)水平

?RT-PCR技術(shù)定性或定量測(cè)定

?研究領(lǐng)域

?生物學(xué)檢測(cè)法

?靶細(xì)胞殺傷、細(xì)胞增殖、細(xì)胞病變抑制法等

?免疫學(xué)測(cè)定

?蛋白含量測(cè)定

一、生物學(xué)檢測(cè)方法

?原理：根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物學(xué)效應(yīng)設(shè)計(jì)的，應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng)與已知活性細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)細(xì)胞因子相互作用，觀察指示系統(tǒng)的變化來(lái)測(cè)定細(xì)胞因子的活性，結(jié)果以活性單位表示。

?常用指示系統(tǒng)

?細(xì)胞增殖或增殖抑制法

?靶細(xì)胞殺傷法

?細(xì)胞病變抑制法

?…

IL-2、IL-6刺激或抑制某些細(xì)胞的增殖

TNF、IFN對(duì)某些腫瘤細(xì)胞有溶細(xì)胞或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的活性

IFN抗病毒活性

二、免疫學(xué)測(cè)定法

?ELISA?化學(xué)發(fā)光酶免疫實(shí)驗(yàn)

?流式細(xì)胞術(shù)

?ELISPOT(一)ELISA方法

?用于細(xì)胞因子、可溶性細(xì)胞因子受體或可溶性粘附因子的定性或定量測(cè)定。

?基本方法有：雙抗體夾心法、間接法和抗原競(jìng)爭(zhēng)法。雙抗體夾心法是細(xì)胞因子測(cè)定的最常用方法。

?特點(diǎn)：

?優(yōu)點(diǎn)：批量檢測(cè)，成本低廉，易推廣，操作簡(jiǎn)單；

?缺點(diǎn)：靈敏度低，不能區(qū)分生物學(xué)活性。

1.檢測(cè)標(biāo)本：

（1）血清、關(guān)節(jié)液、胸腔液、腦脊液或腹腔液等體液：

?用于細(xì)胞因子、可溶性黏附分子、可溶性細(xì)胞因子受體等的檢測(cè)

?正常情況下，血清中多數(shù)細(xì)胞因子含量均低，可選用敏感性高的流式細(xì)胞術(shù)；

?在病理狀態(tài)下，細(xì)胞因子或可溶性黏附分子表達(dá)增加，首選ELISA法。

(一)ELISA方法

?只用于細(xì)胞因子和可溶性細(xì)胞因子受體的檢測(cè)。

?檢測(cè)時(shí)注意檢測(cè)條件：

?選擇適當(dāng)刺激劑：不同刺激劑對(duì)細(xì)胞因子促分泌效應(yīng)不同；

?適時(shí)檢測(cè)：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞因子分泌動(dòng)態(tài)變化；

?選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)時(shí)點(diǎn)：最大分泌峰時(shí)間各異；

（2）細(xì)胞體外培養(yǎng)后上清液

(一)ELISA方法

?標(biāo)本嚴(yán)重溶血：血紅蛋白的血紅素基團(tuán)的過(guò)氧化物酶活性干擾

?微生物污染：可刺激IL-1、IL-6等細(xì)胞因子的分泌，影響結(jié)果準(zhǔn)確性

?離體后標(biāo)本中細(xì)胞繼續(xù)分泌細(xì)胞因子，或與細(xì)胞上的受體結(jié)合或降解

2.干擾因素

(一)ELISA方法

?用于體液中細(xì)胞因子或可溶型細(xì)胞因子受體的定量測(cè)定；

?方法：雙抗體夾心法，ALP或HRP?特點(diǎn)：靈敏度高，線(xiàn)性范圍寬、試劑穩(wěn)定，可自動(dòng)化檢測(cè)。

(二)化學(xué)發(fā)光酶免疫試驗(yàn)

?流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞儀高分辨力所建立的方法；

?主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面粘附分子的檢測(cè)；

?可進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或粘附因子的檢測(cè)；

?精確判斷不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子和膜分子的表達(dá)情況；

?可實(shí)現(xiàn)半定量分析。

(三)流式細(xì)胞術(shù)

1．分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞

2．細(xì)胞破膜與固定

3．封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)

4．染色與分析

基本步驟

(三)流式細(xì)胞術(shù)

1.分離和培養(yǎng)細(xì)胞（PMBC或體外培養(yǎng)的細(xì)胞）

?需進(jìn)行細(xì)胞刺激，刺激物（活化劑）的選擇視待測(cè)細(xì)胞及細(xì)胞因子而定，如：

?T細(xì)胞活化劑（PHA，PMA和CD3單抗等)；

?B細(xì)胞活化劑(LPS，葡萄球菌腸毒素等）；

?單核細(xì)胞活化劑（LPS等）；

?需蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑

?如莫能菌素，阻止細(xì)胞因子分泌，利于胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)

?目的：便于熒光抗體進(jìn)入胞內(nèi)與細(xì)胞因子結(jié)合；

?常用破膜劑：Triton100，皂素；

?細(xì)胞固定：甲醛或乙醇使蛋白變性，防止其流失，且使其固定。常用的細(xì)胞固定劑4%多聚甲醛。

2.細(xì)胞破膜與固定

?目的：阻斷特異性抗體與非特異性位點(diǎn)的結(jié)合，提高方法特異性；

?方法：采用封閉劑如含5%脫脂奶粉、正常血清或不含細(xì)胞因子特異抗體的同種免疫球蛋白處理。

3.封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)

?熒光抗體染色，流式細(xì)胞儀分析熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分率和熒光強(qiáng)度。

?同時(shí)檢測(cè)同一細(xì)胞內(nèi)2種及以上細(xì)胞因子的表達(dá)。

?如同時(shí)檢測(cè)Th細(xì)胞IFN-γ和IL-4的表達(dá)區(qū)分

Th1細(xì)胞Th2細(xì)胞

?細(xì)胞表面的黏附分子或細(xì)胞因子受體：

?無(wú)需作細(xì)胞破膜和固定。

?待測(cè)細(xì)胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細(xì)胞，保持良好狀態(tài)。

4.染色與分析

?標(biāo)本處理：

?新鮮分離或培養(yǎng)的細(xì)胞，狀態(tài)良好。

?避免使用EDTA抗凝，絡(luò)合鈣，限制鈣依賴(lài)性激活途徑，推薦用肝素鈉

?標(biāo)本8h內(nèi)分析

5.注意事項(xiàng)

?對(duì)照選擇

?未刺激對(duì)照：包含蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)劑的未刺激對(duì)照

?激活對(duì)照：測(cè)細(xì)胞表面的CD69的表達(dá)

?同型對(duì)照：消除抗體非特異性結(jié)合。采用熒光標(biāo)記抗體同來(lái)源、同標(biāo)記、同劑量和亞型的免疫球蛋白。

?熒光素選擇

?低表達(dá)、同時(shí)檢測(cè)單一或多種細(xì)胞因子：PE（澡紅蛋白）

?高表達(dá)：FITC（異硫氰酸熒光素）

5.注意事項(xiàng)

(四)ELISPOT抗細(xì)胞因子抗體包被固相載體

加入待檢細(xì)胞

刺激或不刺激

培養(yǎng)一定時(shí)間

分泌的細(xì)胞因子+Ab結(jié)合

加入酶標(biāo)抗體、底物顯色

洗滌去除細(xì)胞

形成斑點(diǎn)

每個(gè)斑點(diǎn)代表單個(gè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞

斑點(diǎn)深淺與含量相關(guān)

基

本

方

法

方法評(píng)價(jià)：

?優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，靈敏度高；

?ELISA是整體水平上的檢測(cè)；

?ELISPOT是單細(xì)胞水平的檢測(cè)；

(四)ELISPOT?測(cè)定是含量，與活性不一定成正比；

?結(jié)果與抗體來(lái)源及親和力有關(guān)；

?敏感性相對(duì)較低；

?可溶性受體干擾結(jié)果。

?特異性高；

?操作簡(jiǎn)便；

?重復(fù)性好，易標(biāo)準(zhǔn)化。

(五)免疫學(xué)測(cè)定方法評(píng)價(jià)

第三節(jié)

細(xì)胞因子與細(xì)胞黏附分子測(cè)定的臨床應(yīng)用

一、臨床應(yīng)用的方面

?特定疾病的輔助診斷；

?機(jī)體免疫狀態(tài)的評(píng)估；

?臨床疾病治療效果的檢測(cè)和指導(dǎo)用藥；

?疾病預(yù)防的應(yīng)用。

（一）細(xì)胞因子在檢測(cè)特定疾病診斷中的意義

?感染性疾病、免疫炎癥、移植排斥反應(yīng)等發(fā)生時(shí)，常出現(xiàn)TNF、IL-1、IL-6、IFN-γ等表達(dá)增加；

?TNF和IL-6：是肝臟損傷的重要炎癥介質(zhì)；

?TNF、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1等水平鑒別診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨性關(guān)節(jié)炎。

?疾病過(guò)程中，細(xì)胞因子和黏附分子表達(dá)異常，還可反映疾病進(jìn)程。

（二）黏附分子檢測(cè)在特定疾病診斷中的意義

?E-鈣粘素：腸道特異的細(xì)胞黏附分子，腸型胃腺癌異位表達(dá)，腺癌分化差的區(qū)域表達(dá)減少，免疫組化分析可作為胃腺癌及其分化程度的早期輔助診斷指標(biāo)。

?CD44：介導(dǎo)細(xì)胞間、細(xì)胞與外基質(zhì)間的黏附，過(guò)量表達(dá)CD44變異體與腫瘤的發(fā)生和擴(kuò)散有關(guān)，可預(yù)示患者體內(nèi)有腫瘤轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性。

?sICAM-1和sVCAM-1：判斷移植排斥反應(yīng)的指標(biāo)，升高提示有發(fā)生排斥反應(yīng)的可能。

評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)、判斷治療效果及預(yù)后

※有助于判斷機(jī)體免疫狀態(tài)；

※其過(guò)高或過(guò)低表達(dá)均系免疫調(diào)節(jié)異常的結(jié)果，導(dǎo)致疾病的發(fā)生；

※作為觀察治療效果和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)；

※在疾病治療中，發(fā)揮重要作用；

※接受治療的患者進(jìn)行細(xì)胞因子水平的監(jiān)測(cè)，對(duì)保證治療效果具有指導(dǎo)意義。

。

二、臨床應(yīng)用原則

（一）方法的聯(lián)合應(yīng)用

?方法多樣，各有利弊

–高敏感性方法：特異性的降低、廢棄物難處理；

–活性測(cè)定方法：定性試驗(yàn)，不能準(zhǔn)確定量。

–基因分析法：利于細(xì)胞內(nèi)分析，