影響鵝掌楸繁殖性能的遺傳效應(yīng)分析

影響鵝掌楸繁殖性能的遺傳效應(yīng)分析

現(xiàn)在只有兩種類型的鵝棗。1963年,我國著名植物育種家葉培忠教授以鵝掌楸為母本、北美鵝掌楸為父本進行了人工雜交試驗,獲得了鵝掌楸屬的種間人工雜種(南京林產(chǎn)工業(yè)學(xué)院林學(xué)系育種組,1973)。雜種鵝掌楸表現(xiàn)出非常明顯的雜種優(yōu)勢,生長旺盛,適應(yīng)能力強,病蟲害少,樹形美觀,枝葉濃密、生長期長,花色鮮艷(王章榮,2005)。但鵝掌楸屬的雜交育種研究工作一直受到親本繁殖能力低的限制,而繁殖能力低下也是鵝掌楸天然群體瀕危的重要原因之一(秦慧貞等,1996)。關(guān)于這個問題,許多學(xué)者在鵝掌楸胚胎學(xué)和交配系統(tǒng)方面開展了大量研究。樊汝汶等(1990)發(fā)現(xiàn)鵝掌楸胚發(fā)育中存在原胚和胚乳發(fā)育不協(xié)調(diào)的現(xiàn)象,隨后尹增芳等(1994;1997)和秦慧貞等(1996)分別對鵝掌楸雌雄配子敗育進行了細致研究,周堅等(1994)對鵝掌楸屬植物的花粉品質(zhì)和花粉管生長進行了研究,這些研究分別證實了雌、雄配子敗育是鵝掌楸繁殖能力低下的重要原因。在交配系統(tǒng)研究方面,方炎明等(1994)通過對鵝掌楸天然群體與人工群體的生育力比較認為生育力低的原因可能是花粉限制,黃雙全等(1998b)通過對花部數(shù)量變異與結(jié)實率研究認為可能是資源配量限制了結(jié)實率。關(guān)于鵝掌楸繁殖能力低下的問題就此形成了“花粉限制(pollenlimitation)”與“資源限制(resourcelimitation)”2種觀點。但二者都缺乏從遺傳學(xué)角度的研究支持。因此開展鵝掌楸屬樹種交配親和性及其遺傳基礎(chǔ)研究對于鵝掌楸的繁殖能力評價、雜交親本選配及雜種優(yōu)勢利用有重要的理論與現(xiàn)實意義。雙列交配設(shè)計可以同時估算一般配合力(GCA)和特殊配合力(SCA)等遺傳參數(shù),而且具有統(tǒng)計上的穩(wěn)定性(Kearsey,1965;Pederson,1972),是非常理想的遺傳分析模型,因而在作物和林木遺傳育種中得到廣泛應(yīng)用(Vermaetal.,2003;Allahgholipouretal.,2006;Kumarietal.,2008;金國慶等,2008)。本研究以鵝掌楸、北美鵝掌楸各4株成年個體作為交配親本,在檢測各親本花粉活力基礎(chǔ)上,通過全雙列交配設(shè)計,以各組合子代出苗率作為其繁殖性能指標(biāo),進而估算繁殖性能的母本效應(yīng)、父本效應(yīng)、父母本交互作用效應(yīng)、一般配合力與特殊配合力等遺傳效應(yīng),并分析各類遺傳效應(yīng)的相對重要性大小。同時,利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)估算各交配親本間遺傳距離,以探討親本遺傳距離對交配繁殖性能的影響。1材料和方法1.1設(shè)置虎林或虎林,進入盛花期和盛果期交配親本來自江蘇句容南京林業(yè)大學(xué)下蜀實習(xí)林場的鵝掌楸屬種源試驗林。試驗林包含12個鵝掌楸種源和5個北美鵝掌楸種源,樹齡14年,已進入盛花期和盛果期(李火根等,2005)。2007年5月,在試驗林內(nèi)隨機選取4株成年鵝掌楸及4株成年北美鵝掌楸作為交配親本(表1)。1.2花粉的培養(yǎng)b為排除各雜交親本花粉活力差異影響,控制授粉前對各親本的花粉活力進行了測定。采集未開放的花苞,每個親本5~8朵,要求同一時間段在樹冠相同冠層采集;水培2天后收集花粉,用10%蔗糖+50mg·L-1硼酸+1%瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉2.5h(徐進等,2001);用顯微鏡觀察花粉萌發(fā)狀況,每樣品重復(fù)觀察3次,每次觀察5個視野,計算萌發(fā)率。1.3種子出苗率測定2007年5月,對8株雜交親本分別用毛竹搭架,按8×8全雙列交配設(shè)計進行控制授粉。2007年10月采種,共獲得63個交配組合的種子(SZ自交組合未收獲到種子)。每個組合篩選相對飽滿的種子進行出苗率測定。采用完全隨機區(qū)組設(shè)計,4次重復(fù),每重復(fù)每組合各100粒翅果,2008年2月播種于南京江浦橋林苗圃,同年5月統(tǒng)計各組合的場圃發(fā)芽率。1.4ssr-pcr擴增親本基因組DNA采用改進的CTAB裂解-硅珠吸附法進行提取(張博等,2004)。紫外分光光度計檢測純度,置于4°C冰箱保存?zhèn)溆?。試驗所用的引物來自于本實驗室從北美鵝掌楸EST序列中開發(fā)出的SSR引物(Xuetal.,2010),篩選11對通用性好、多態(tài)性高的SSR引物用于本研究。SSR-PCR反應(yīng)體系為10μL,包含20~24ng樣本DNA,1×PCR緩沖液(Tris-HCl10mmol·L-1pH8.0,KCl50mmol·L-1),0.26mmol·L-1Mg2+,0.2mmol·L-1dNTP,正反引物各0.25μmol·L-1,Taq聚合酶0.25U(張博等,2004)。擴增反應(yīng)程序采用Touch-DownPCR:94℃預(yù)變性4min,隨后15個Touch-Down循環(huán)(94℃變性15s,60℃退火15s,72℃延伸30s,每次循環(huán)的退火溫度降0.7℃),再進入15個主循環(huán)(94℃變性15s,49.5℃退火15s,72℃延伸30s),最后20min延伸反應(yīng)。SSR-PCR產(chǎn)物采用8%的聚丙烯酰胺變性凝膠電泳,銀染檢測。對電泳條帶判讀后,利用PopGen32軟件估算親本間遺傳距離(Yehetal.,2000)。1.5遺傳參數(shù)方差分析統(tǒng)計各交配組合子代的場圃出苗率作為其繁殖性能指標(biāo),計算各親本繁殖性能的一般配合力(GCA)及各交配組合的特殊配合力(SCA)。鑒于鵝掌楸雌、雄繁殖性能差異較大,所以在估算親本的GCA時,分別雌、雄繁殖性能進行估算。式中,GCAm為雌性繁殖性能的GCA,gi·為第i個母本的GCAm,為第i個母本的所有組合的均值,GCAf為雄性繁殖性能的GCA,g·j為第j個父本的GCAj,為第j個父本的所有組合的均值,xij為第i個母本和第j個父本交配組合值,u為總平均值(顧萬春,2004)。采用SAS8.1軟件,以yijk=μ+Fi+Mj+Dij+eijk為線性模型對父母本效應(yīng)進行方差分析。式中,yijk為第i個母本和第j個父本交配子代在第k區(qū)組的觀測值;μ是群體平均值;Fi和Mj分別為母本效應(yīng)、父本效應(yīng);Dij為父母本交互作用效應(yīng);eijk為隨機誤差。在對父母本效應(yīng)進行判斷后,采用yijk=μ+gi+gj+sij+rij+eijk線性模型分析GCA,SCA及正反交效應(yīng)。式中,yijk為第i個母本和第j個父本交配子代在第k區(qū)組的觀測值;μ是群體平均值;gi和gj為一般配合力效應(yīng);sij為特殊配合力效應(yīng);rij為正反交效應(yīng);eijk為隨機誤差。根據(jù)方差分析結(jié)果進一步估算遺傳率。遺傳率的計算方法(朱軍,1997)為:式中,hB2,hN2分別為廣義遺傳率與狹義遺傳率,σG2為遺傳方差,σA2為加性方差,σg2為一般配合力方差,σs2為特殊配合力方差,σr2為平均親本效應(yīng)方差,σe2為環(huán)境方差。2結(jié)果與分析2.1織物上添加0.2%97.2%的多步法以親本的花粉萌發(fā)率表示其花粉活力。8株親本的花粉萌發(fā)率(表2)均較高,在75.1%~96.2%之間。方差分析結(jié)果表明,花粉萌發(fā)率在8株親本間差異不顯著(F值為0.45,未達0.05差異顯著性水平),說明花粉活力對該批親本繁殖性能的影響可以忽略。2.2種間雜交繁殖性能以各交配組合子代的場圃出苗率作為各組合的繁殖性能。表3列出了63個交配組合的繁殖性能(場圃發(fā)芽率)。63個組合平均繁殖性能為16.26%,其中,鵝掌楸種內(nèi)交配組合為15.33%,北美鵝掌楸種內(nèi)交配組合為18.44%,種間雜交組合繁殖性能為15.79%。種間交配組合中,LYS×SZ最高為32.00%,FY×NK最低為0.50%;種內(nèi)交配組合中,LS×SZ最高為35.50%,FY×WYS和FY×LS最低為0。所有自交組合的繁殖性能均不超過1%。進一步對各組合繁殖性能利用SASv8.1軟件進行方差分析,結(jié)果顯示,各交配組合間繁殖性能差異顯著,而區(qū)組間差異不顯著(表4),表明各雜交組合的繁殖性能差異主要與交配親本的遺傳組成有關(guān)。2.3繁殖性能及配合力由于親本SZ未獲得自交子代,且自交組合育性極低,因此,在估算各親本繁殖性能配合力時,為了親本間比較的一致性,僅以56個正反交組合對各雜交親本的繁殖性能配合力進行估算(表5)。雌性繁殖性能的一般配合力(GCA):親本LYS最高,達11.17;FY最低,僅-14.85。雄性繁殖性能GCA:親本FY最高,為3.67;LYS最低,為-2.92。平均繁殖GCA最高的是親本LYS,為4.13;最低的是FY,為-5.59。各親本間的雌性繁殖GCA差異大于雄性繁殖GCA,同一親本的雌、雄繁殖性能的GCA差異也較大。表6列出了各交配組合繁殖性能的特殊配合力(SCA)。從中可以看出,繁殖性能的SCA在不同交配類型間差異較大,總體上,種內(nèi)交配的SCA遠高于種間雜交。56個正反交組合中,LS×SZ最高,達13.74;LS×NK最低,僅為-10.49。為進一步分析配合力效應(yīng)對鵝掌楸繁殖性能的影響程度,采用雙列雜交方差分析模型(Griffing,1956)對GCA效應(yīng)、SCA效應(yīng)和正反交效應(yīng)的方差分量進行無偏估算。結(jié)果表明:對于鵝掌楸繁殖性能,親本間的GCA效應(yīng)、SCA效應(yīng)和正反交效應(yīng)均達極顯著水平;在總遺傳方差中,三者所占比率分別為17.71%,21.43%和60.87%(表7)。2.4合繁殖性能的方差分析為進一步分析影響鵝掌楸繁殖性能的父、母本效應(yīng),采用SASv8.1統(tǒng)計軟件對各雜交組合繁殖性能進行方差分析(表8)。從中可以看出,母本效應(yīng)與交互效應(yīng)均達到差異顯著水平,而父本效應(yīng)差異不顯著。母本效應(yīng)的方差分量占總遺傳方差的71.22%,而父本效應(yīng)方差分量占總遺傳方差的0.01%,這表明鵝掌楸的繁殖性能主要受母本遺傳效應(yīng)影響。2.5顯色反交方向上正反交的方差分量根據(jù)加性方差VA=2σg2,顯性方差VD=σs2,估算出鵝掌楸繁殖性能的加性方差、顯性方差分別為29.9,18.9。由親本效應(yīng)分析結(jié)果可知,鵝掌楸的繁殖性能的父本效應(yīng)極低,幾乎可以忽略不計。因此,可將正反交效應(yīng)的方差分量作為母本效應(yīng),即VF=2σr2。估算出鵝掌楸繁殖性能的廣義遺傳力為0.776,狹義遺傳力為0.154。2.6種內(nèi)雜交組合間的繁殖性能特殊配合力的應(yīng)用基于12個SSR位點信息,利用PopGen32軟件估算8個雜交親本間的遺傳距離(GD)(表9)。種間雜交組合中,親本間遺傳距離最大2.853(SZ與BM),最小0.629(FY與LYS),平均為1.475;種內(nèi)雜交組合中,親本間遺傳距離最大1.28(BM與MSL),最小0.405(LYS與MSL),平均為0.816。為了解親本遺傳距離與雜交親和性之間的關(guān)系,以各交配組合的繁殖性能特殊配合力作為雜交親和性的度量指標(biāo),將親本遺傳距離與各交配組合的繁殖性能特殊配合力進行相關(guān)分析(圖1)。結(jié)果顯示,總體上,二者相關(guān)性不明顯(相關(guān)系數(shù)為-0.09,顯著性水平P=0.52),但也存在一定的趨勢:多數(shù)種內(nèi)交配組合雙親的GD值在0.4~1之間,其SCA隨著GD增大而升高(相關(guān)系數(shù)為0.31,顯著性水平P=0.18);而大多數(shù)種間交配組合的GD值在0.6~2之間,SCA隨著GD減小而增大(相關(guān)系數(shù)為-0.56,顯著性水平P=0.002)。3結(jié)論和討論3.1全雙列雜交組合子代繁殖性能評價某種植物的繁殖能力可以從不同的生物學(xué)指標(biāo)入手(Suitoretal.,2009),例如其對繁殖資源的配置投入、產(chǎn)種量或最終成活子代的數(shù)量。成年的鵝掌楸配置了大量繁殖資源(李火根等,2007;馮源恒等,2010),但得到的子代數(shù)量卻很低(方炎明等,1994),這說明鵝掌楸的繁殖成功率不高。本研究利用鵝掌楸全雙列雜交組合子代出苗率作為度量其繁殖性能指標(biāo),分析結(jié)果顯示,鵝掌楸繁殖性能主要決定于母本效應(yīng),父本效應(yīng)非常微弱。由此可見,在對鵝掌楸不同交配組合的繁殖性能進行評價時,應(yīng)以其雌性繁殖能力作為主要指標(biāo)。3.2雞掌楸結(jié)構(gòu)特征在以往的研究中,關(guān)于影響鵝掌楸自然條件下結(jié)實率低的因素一直存在2種觀點,即“花粉限制(pollenlimitation)”與“資源限制(resourcelimitation)”。方炎明等(1994)通過對鵝掌楸天然群體與人工群體的生育力研究發(fā)現(xiàn)飽滿翅果數(shù)與總翅果數(shù)之間不存在負相關(guān),認為鵝掌楸生育力低可能是受花粉限制。采用人工授粉可以明顯提高結(jié)實率的事實為這一觀點提供了有力的支持,但該觀點并未進行關(guān)于雌配子體敗育對結(jié)實率影響的討論。黃雙全等(1998b)發(fā)現(xiàn)自然傳粉的單果結(jié)實率也可高達67.4%,對雌性較高的資源投資有利于結(jié)實,且鵝掌楸聚合果中存在著種子選擇性敗育現(xiàn)象,并結(jié)合秦慧貞等(1996)關(guān)于鵝掌楸胚囊發(fā)育率較高的居群其結(jié)實率也較高的結(jié)論,提出鵝掌楸結(jié)實率低的資源限制說(黃雙全等,1998a)。本研究獲得的鵝掌楸繁殖主要受母本遺傳控制這一結(jié)論為“胚珠限制”假說提供了有力支持,同時也說明通過選擇繁殖性能強的母本可提高鵝掌楸結(jié)實率。3.3復(fù)配組合特性將親本遺傳距離與表型性狀進行相關(guān)研究是分子遺傳學(xué)與常規(guī)育種研究的重要結(jié)合點(Kiulaetal.,2008;Stelkensetal.,2009;Kimetal.,2010)。有研究表明親本間遺傳變異程度可作為親本選配和子代預(yù)測的依據(jù)(Joseetal.,2005;李善文等,2007),但也有研究發(fā)現(xiàn)親本的遺傳距離與子代性狀雖存在相關(guān)性,但其相關(guān)程度較低(Koppetal.,2002;Yuetal.,2005)。本研究將各雜交組合繁殖性能的特殊配合力作為雙親雜交親和性的度量指標(biāo),分析親本遺傳距離與交配組合繁殖性能的特殊配合力二者的相關(guān)性。從分析結(jié)果來看,雖然總體上,二者相關(guān)性不顯著,但也可看出一定的趨勢。當(dāng)雙親的遺傳距離小于1時,二者雜交親和性較好,遺傳距離大于1時,則雜交親和性會隨之降低。對比各親本對遺傳距離值,不難發(fā)現(xiàn),大多數(shù)種內(nèi)交配組合的親本間遺傳距離小于1,而大多