4催化反應動力學-4別構反應全解

酶學彭益強Enzymology國立華僑大學生物工程與技術系第一節(jié)單底物反響動力學其次節(jié)抑制作用動力學第三節(jié)多底物反響動力學第四節(jié)別構酶動力學第五節(jié)pH和溫度對酶催化反響速度的影響主要內容第四章酶催化反響動力學第四節(jié)別構酶反響動力學酶與一般催化劑不同的特點：可調整性；30%酶動力學不符合米氏方程，大多是寡聚酶，受代謝物調整，但代謝物構造不類似于被調整酶底物；60年月，Jacob與Monod提出別構理論，反響調整作用稱為別構效應。非唯一調整方式，卻是較為重要的一類。例

子ATC酶經過溫順的化學處理，如用對羥基汞苯甲酸〔PCMB〕處理可解聚為兩個催化亞基〔為三聚體〕和3個調整亞基〔為二聚體〕。催化亞基仍有催化活力，但不再受效應物影響，調整亞基無催化活力，但仍能結合效應物。更猛烈的處理，如用十二烷基硫酸鈉〔SDS〕處理，則催化亞基和調整亞基都各解聚成6個單體主要內容一、配體〔底物〕與蛋白質結合中協(xié)同效應(link)二、別構酶的性質、構造及動力學特性(link)三、別構效應(link)go一、配體〔底物〕與蛋白質結合中協(xié)同效應指蛋白質與一個配體〔底物和效應物〕結合后可影響蛋白質與另一個配體結合力量；據此分類：1，正協(xié)同效應-激活；2，負協(xié)同效應-抑制；3，同促效應〔同種協(xié)同效應,homotropiceffect〕一個配體與酶結合后，引起酶分子構象變化，從而轉變后續(xù)一樣配體對酶的親和力；4，異促效應〔異種協(xié)同效應,heterotropiceffect〕一種配體與酶結合引起另一種配體對酶親和力的轉變；多數別構酶兼有同促效應和異促效應?！惨弧硡f(xié)同效應〔二〕配體與蛋白質結合E+SES結合常數：Kb=[ES]/[E][S],

Kb=K-1S,蛋白質飽和分數Y：[E0]恒定下，Y對[S]作圖為一雙曲線；在穩(wěn)態(tài)下，亦是一雙曲線。此是米氏方程特性!1、與具單個結合部位的蛋白質結合2、與具多個結合部位的蛋白質結合最簡潔情形：二聚體蛋白兩個一樣配體結合位，同種正協(xié)同作用：M2+2SM2S2結合常數:Kb=[M2S2]/[M2][S]2蛋白質飽和分數：Y=[M2S2]/[〔M2〕0]=Kb[S]2/(Kb[S]2+1)Y~[S],是S形曲線Hill方程結合常數取對數：更一般地，n個一樣結合位之蛋白質通式：即為Hill方程；抱負條件下Lg(Y/(1-Y))~lgS作圖；即為Hill曲線圖，線性，斜率為n，縱截矩lgKb；試驗中測定的斜率n為Hill系數h;例：血紅蛋白Hill系數多結合位蛋白與配體之間的結合爭論是基于氧和血紅蛋白結合之爭論；1904，Bohr,繪制了血紅蛋白與氧結合的飽和分數Y對氧分壓的圖形，是S形曲線；1909,Hill基于結合部位之間相互影響引起正協(xié)同效應來解釋此曲線；假設血紅蛋白有n個亞基，總反響式：Hb+nO2Hb(O2)n在根底上推導出Hill方程；做為含有4個氧結合位的血紅蛋白，其斜率應為4氧飽和度YpO2血紅蛋白S形氧合曲線雖與試驗數據有偏，但此方程很好地適合了血紅蛋白氧合曲線及其它別構蛋白的協(xié)同過程，因此其數據處理方法即Lg(Y/(1-Y))~lgPO2作圖法〔Hill作圖法〕得到應用。血紅蛋白氧合具高協(xié)同性，因此極高或極低氧下只結合一個氧分子，兩端斜率為1;中間氧濃度區(qū)協(xié)同性最好大，h=2.8,但曲線斜率總不會達4這個亞基數；目前其構造根底已初步說明：1960，Perutz，4個結合位血紅素完全分別，相互作用不行能，可能是亞基間作用，氧合中4個氧結合也不一樣，第一個需翻開鹽鍵更多些，第4個更少，故呈S形曲線！斜率=1斜率=10氧飽和百分數Lg(Y/(1-Y))第1個O2第4個O2PO2血紅蛋白Hilll圖back二、別構酶的性質、構造及動力學特性別構作用：指不同于底物的物質對酶起到激活或抑制作用；別構酶：具不止一個配基結合位的酶，活性位外的部位可與和底物構造完全不同的物質結合，結合后通過構象變化影響底物與活性位的作用從而對酶催化產生正或負影響；覺察起源：反響調整；1，50年月，Umbarger,L-蘇氨酸到L-異亮氨酸五步反響，當異亮氨酸過量則對第一步酶蘇氨酸脫水酶產生反響抑制！2，Gerharf嘧啶核苷酸合成途徑中覺察終產物CTP抑制第一步酶，天冬氨酸轉氨甲酰酶〔ACTase)。〔一〕別構酶性質和構造某些酶的分子外表除活性中心外，尚有調整部位，當調整物〔或稱別構物〕結合到此調整部位時，引起酶分子構象變化，導致酶活性轉變，這類酶稱為變/別構酶。3.6重要的酶§3.6重要的酶變構酶與變構調整概念變構酶又稱為別構酶，指酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價結合后，引起酶的構象的轉變，進而轉變酶的活性狀態(tài)，酶的這種調整作用稱為變構調整(allostericregulation)，具有變構調整的酶稱變構酶(allostericenzyme)。凡能使酶分子發(fā)生別構作用的物質稱為變構劑(effector)。變構酶多為寡聚酶，含的亞基數一般為偶數；且分子中有催化部位〔結合底物〕與調整部位〔結合變構劑〕，這兩部位可以在不同的亞基上，或者在同一亞基的兩個不同部位。效應物〔effecter〕———不作用于活性中心，而是活性中心以外的部位，引起分子構象變化，來調整酶活力。此效應物為別位效應劑(allostericeffecter)§3.6重要的酶特點：①一般為寡聚酶②有別構位和催化位③作用曲線往往為S形別構酶構造特性：〔1〕有多個亞基〔2〕有四級構造〔3〕酶分子中除了有結合底物并催化反響的活性中心外，還有可以結合調整物的別構中心?；钚灾行暮蛣e構中心可能位于不同的亞基或一樣的亞基的不同部位?！?〕活性用于結合底物，別構中心用于調整速度；〔5〕有時因物理化學作用脫敏，但正常催化活性未失，表現出米氏方程雙曲線動力學特征?！捕硠恿W特性與米氏曲線比較：留意：別構酶往往具有S曲線特征，但反之不亦然！1米氏特征曲線2正協(xié)同S曲線3負協(xié)同曲線[S]v§3.6重要的酶S形曲線動力學特征S形曲線有利于反響速度的調整！與米氏曲線比較：因此S曲線表達為當底物濃度發(fā)生很小變化時，別構酶可以極大程度掌握反響速度30.119vmax100%AB[S]90%v[S]10%v=81[S]90%v[S]10%v=3§3.6重要的酶變構酶作用特點1、一般變構酶分子上有二個以上的底物結合位點。當底物與一個亞基上的活性中心結合后，引起酶分子構象的轉變，使其它亞基的活性中心與底物的結合力量發(fā)生轉變，或消失正協(xié)同效應(positivecooperativeeffect)，或消失負協(xié)同效應〔negativecooperativeeffect〕。2、正協(xié)同效應的變構酶其速度-底物濃度曲線呈S形，即底物濃度較低時，酶活性的增加緩慢，底物濃度高到肯定程度后，酶活性顯著加強，最終到達最大值Vmax。如大腸桿菌的天冬氨酸轉甲?；浮睞TCase〕對底物天冬氨酸的結合表現為正協(xié)同效應?！?.6重要的酶3、負協(xié)同效應的變構酶其速度-底物濃度曲線為類似雙曲線。底物濃度較低時，酶表現出較大活性，但底物濃度明顯增加時，其反響速度無明顯變化。如3-磷酸甘油醛脫氫酶對NAD+的結合為負協(xié)同效應，其意義在于無論細胞內酶的底物濃度如何變化，酶始終能以一個較恒定的速度進展以滿足細胞的根本需要。§3.6重要的酶4、變構酶除活性中心外，還存在著能與變構劑作用的亞基或部位，稱調整亞基(或部位)。變構劑與調整亞基以非共價鍵特異結合，可以轉變調整亞基的構象，進而轉變催化亞基的構象，從而轉變酶活性。凡使酶活性增加的變構劑稱變構激活劑(allostericactivitor)，它能使上述S型曲線左移，飽和量的變構激活劑可將S形曲線轉變?yōu)榫匦坞p曲線。凡使酶活性減弱的變構劑稱變構抑制劑(allostericinhibitor)，能使S形曲線右移。例如，ATP是磷酸果糖激酶的變構抑制劑，而ADP、AMP為其變構激活劑。5、由于變構酶動力學不符合米-曼氏酶的動力學，所以當反應速度到達最大速度一半時的底物的濃度，不能用Km表示，而代之以K0.5S表示?！?.6重要的酶正協(xié)同效應的變構酶底物活性曲線⊙不加變構劑⊙加變構激活劑⊙加變構抑制劑+-back三、別構效應別構效應〔allostericeffect〕：調整物或效應物與酶分子上的別構中心結合后，誘導出或穩(wěn)定住酶分子的某種構象，使酶活性中心對底物的結合和催化作用受到影響，從而調整酶反響速度及代謝過程，此效應即為酶的別構效應。主要內容1、別構效應生理調整功能;2、別構效應的類型推斷法;3、變構酶活性調整的機理與模型.1、別構效應生理調整功能別構調整是快速影響酶活的一種重要方式,通常處于代謝途徑之起點或分叉點或關鍵點、限速點；例1：天冬氨酸氨甲酰轉移酶是起始點關鍵酶受CTP抑制和ATP激活；例2：膽固醇合成途徑中部甲羥戊二酸CoA復原酶是其限速酶，終產物膽固醇是其別構調整物；協(xié)同效應之作用正協(xié)同效應使得配體濃度在肯定區(qū)間內酶反響速度對其變化特別敏感，而在區(qū)間外不敏感；例：同時受幾種酶作用之底物參與幾個代謝途徑，底物流量安排可通過正協(xié)同效應別構酶實現，如氨甲酰磷酸受天冬氨酸氨甲酰轉移酶正協(xié)同效應合理安排產CTP和Arg;負協(xié)同效應供給了配體濃度變化對酶反響速度不敏感區(qū)；例：假設某底物很多酶均需要，此途徑特殊重要，負協(xié)同效應可使該途徑穩(wěn)定進展下去，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶對NAD+產生負協(xié)同效應，使之穩(wěn)定產生而不管其它反響對NAD+的影響。變構酶的動力學及變構酶對酶反響速度的調整1.大多數變構酶具有正協(xié)同效應〔酶分子結合一分子底物或效應物后，酶的構象發(fā)生變化，這種新的構象有利于后續(xù)分子與酶的結合，大大促進后續(xù)分子與酶的親合性〕，其初速度與底物濃度的關系呈S形的v-[S]曲線。當底物濃度發(fā)生很小的變化時，變構酶就極大地掌握著反響速度。在正協(xié)同效應中使得酶反響速度對底物濃度的變化極為敏感。2.另一類別構酶具有負協(xié)同效應，其動力學曲線在表現上與雙曲線相像，但意義不同：具有負協(xié)同效應的酶在底物濃度較低的范圍內酶活力上升快，但再連續(xù)下去，底物濃度雖有較大的提高，但反響速度上升卻較小。使得酶反響速度對底物濃度的變化不敏感[s]正負v§3.6重要的酶生理意義及實例1、在正協(xié)同效應的變構酶的S形曲線中段，底物濃度稍有降低，酶的活性明顯下降，多酶體系催化的代謝通路可因此而被關閉；反之，底物濃度稍有上升，則酶活性快速上升，代謝通路又被翻開，因此可以通過細胞內底物濃度的變化來靈敏地掌握代謝速度。2、變構抑制劑常是代謝通路的終產物，變構酶常處于代謝通路的入口，通過反響抑制，可以及早地調整整個代謝通路，削減不必要的底物消耗。§3.6重要的酶§3.6重要的酶例如葡萄糖的氧化分解可供給能量使AMP、ADP轉變成ATP，當ATP過多時，通過變構抑制劑ATP抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而ADP、AMP增多時，則可通過變構激活劑AMP、ADP激活磷酸果糖激酶的活性促進糖的分解。隨時調整ATP/ADP的水平，可以維持細胞內能量的正常供給?！?.6重要的酶§3.6重要的酶2、別構效應的類型推斷法主要有以下3種：〔1〕v~[S]〔2〕雙倒數作圖法〔3〕Hill作圖法〔1〕作圖法v~[S]又稱米氏作圖1,符合米氏方程的無協(xié)同效應，直角雙曲線；2,S曲線的為正協(xié)同效應；3,非直角雙曲線；SvOSvOSvO米正負[S]v雙倒數作圖即L-B作圖法；1，無協(xié)同時直線；2，正協(xié)同上凸；3，負協(xié)同下；1/[S]1/vO1/[S]1/vO1/[S]1/vOHill作圖對別構酶而言Hill方程：lg(v/(vmax-v))~lgS作圖斜率為n，縱截矩lgKs，橫截矩〔lgKs)/n;v=0.5vmax時[S]0.5,有：lg[S]0.5=1/nlgK0.5S[S]0.5相當米氏方程中的KmHill作圖斜率稱:Hill系數或協(xié)同系數，h表示之，可知有：h=1米氏類型酶h1具有正協(xié)同效應的別構酶h1具有負協(xié)同效應的別構酶lg[S]lg(v/(vmax-v))n>1olg[S]lg(v/(vmax-v))n<1olg[S]lg(v/(vmax-v))n=1o〔4-66〕E+nSESnE+nPn]['][+=SKmSVmvn

v

bnxy

KmS

n

v

Vm

-=-

=

-\logloglogKmSvVmv

n=-Hill系數Hanes作圖法[S]

v[S]正協(xié)同負協(xié)同無協(xié)同Eadiehofstee法v[S]v正協(xié)同負協(xié)同無協(xié)同〔2〕協(xié)同指數Koshland標準：CI〔cooperativityindex〕協(xié)同指數：酶分子中的結合位點被底物飽和90%和10%時底物濃度的比值。亦稱飽和比值Rs(saturationratio)Rs=81米氏類型酶Rs

81具有正協(xié)同效應的別構酶Rs

81具有負協(xié)同效應的別構酶酶與底物結合達90%飽和度時底物濃度酶與底物結合達10%飽和度時底物濃度

Rs=協(xié)同指數推導由4-66可得：用v=0.9vmax,v=0.1vmax代入得：從而有：因而有協(xié)同指數：米氏方程CI〔Rs〕=81n=1正協(xié)同CI〔Rs〕<81n>1負協(xié)同CI〔Rs〕>81n<13、變構酶活性調整的機理與模型序變模型〔KNF模型〕—描述異促效應更適合齊變模型(MWC模型)—不適用于負協(xié)同〔1〕MWC模型1965,同Monod,Wyman,Changeux提出，同構模型，對稱模型，定義：〔1〕寡聚體(oligomer)由肯定數量但數目不大亞基組成；〔2〕一樣亞基為原體〔protomer);〔3〕單體指完全解離的原體；如兩原體假設,不同構象狀態(tài)亞基不利作用，故全是R〔松弛高活性〕或T〔嚴密低活性〕，兩種構象狀態(tài)在無配體時處于平衡,底物〔配體〕的結合打破此平衡，這樣就能對協(xié)同效應給解釋！MWC模型示意圖T態(tài)(對底物親和力低)R態(tài)(對底物親和力高)+S+SRR濃度[R0]，TT濃度[T0]；R0T0平衡常數L=[T0]/[R0]；(1)當底物不與T態(tài)酶結合時:R0+SR1R1+SR2KR微觀解離常數：KR=2[S][R0]/[R1][R1]=2([S]/KR)[R0]KR=[S][R1]/2[R2][R2]=([S]2/KR2)[R0]飽和分數YS=[被底物占據的活性位]/[總活性位]則有：相應式子代入有：2提示:進展書面推導:設α=[S]/KR2(4-76)(2)T狀態(tài)也可和配體結合，解離常數KT：KT=2[S][T0]/[T1]KT=[S][T1]/2[T2]；一般地，n個亞基聚體，第i個配體結合時，有：KT類似；設c=KR/KT,a=[S]/KR則處于R態(tài)的酶為：T態(tài)酶亦然；配體占據總活性位飽和分數：提示:進展書面推導C當n=2時:KT=2[S][T0]/[T1]KT=[S][T1]/2[T2](4-81)CMWC模型解釋其協(xié)同效應是基于Rn/Tn的平衡；無配體時，L很大，趨向T態(tài)；配體濃度較高時，Rn/Tn平衡受到擾動，更多Rn從Tn生成，產生更多的RnS，RnS2絡合物直至Tn全部轉變成Rn,因此整個結合曲線是S型，是正協(xié)同效應特征；不能解釋同種負協(xié)同效應MWC模型〔2〕KNF模型1966年Koshland,Nemethy,Filmer提出，漸變模型；不同點：〔1〕無底物時不存在R0-T0的平衡,T到R是配基的誘導;〔2〕假設由n全亞基構成,則由T到R態(tài)不是同時進展的,存在RT狀態(tài);〔3〕可以是正或負協(xié)同效應;+S+STTRTRR以二亞基酶為例，O表示T態(tài)，口表示R態(tài)，KtTR,T到R的平衡常數;KSR,S與R結合的平衡常數;KTR,S與T結合的絡合常數;過程如下：SSKtTRKSRKTRKTTKNF模型形態(tài)與教材規(guī)定的相反!以OO為標準態(tài),相對濃度為1,如要計算濃度則有:S+OSOKTR×OSOS=KTRSO=2KTRS×OSOOO=[2KTRKtTRKSR[S]/KTT]SO=2KTRKtTRKSR[S]令KTT=1則有:(1)(2)+

SSKSRS[S]×=KSR(3)KtTRKtTR=(3)代入(2)得S再將其代入(1)得SO=2KTR