大腸菌群測(cè)定報(bào)告

奶粉的大腸菌群檢驗(yàn)方法大腸菌群的定義

大腸菌群：一群在37℃，經(jīng)24h能發(fā)酵乳糖，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧生長(zhǎng)的革蘭氏陰性的無芽孢桿菌。

其中包括有大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌）、腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯氏菌屬中的一部分和沙門氏菌屬的第Ⅲ亞屬。P139IMViC實(shí)驗(yàn)：I：靛靛基基質(zhì)質(zhì)，，吲哚試驗(yàn)：某些細(xì)菌有色氨酸酶，能分解色氨酸形成吲哚；將對(duì)二甲基氨基苯甲醛加入細(xì)菌蛋白胨水培養(yǎng)液中，吲哚與試劑中的對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，呈紅色反應(yīng)，形成玫瑰吲哚，為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性。不出現(xiàn)紅色則為陰性。M：甲基紅MR試驗(yàn)：產(chǎn)氣腸桿菌使丙酮酸脫羧后形成中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液PH〉5.4。甲基紅指示劑呈橘黃色，為甲基紅試驗(yàn)陰性，大腸埃希菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，培養(yǎng)液呈酸性PH〈5.4，指示劑甲基紅呈紅色，稱甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性。V：V-P試驗(yàn)：大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為區(qū)分兩菌可采用V-P試驗(yàn)及甲基紅試驗(yàn)。產(chǎn)氣腸桿菌能使丙酮酸脫羧，氧化（在堿性溶液中）生成二乙酰，后者可與含胍基的化合物反應(yīng)，生成紅色化合物，稱V-P試驗(yàn)陽(yáng)性；大腸埃希菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，V-P試驗(yàn)陰性。C：檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：能利用枸櫞酸鹽（即檸檬酸）作為唯一探員的細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，同時(shí)分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基呈堿性是，使指示劑溴麝香草酚藍(lán)（BTB）由淡綠轉(zhuǎn)為深藍(lán)，此為枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性。大腸桿菌的定義

大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、

IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為++--或-+--的細(xì)菌。

大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。

與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37℃培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5℃培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌（依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)）衛(wèi)生學(xué)意義

大腸菌群和大腸桿菌作為食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的意義在于，是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。

另外，腸道致病菌如沙門氏菌屬和志賀氏菌屬等，對(duì)食品安全性威脅很大。經(jīng)常檢驗(yàn)致病菌有一定困難。而食品中的大腸菌群較容易檢出，腸道致病菌與大腸菌群的來源相同，而且在一般條件下大腸菌群在外環(huán)境中生存時(shí)間也與主要腸道致病菌一致．所以大腸菌群的另一重要食品衛(wèi)生意義是作為腸道致病菌污染食品的指示菌．

大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)：此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0

μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。大腸桿菌的生物學(xué)特性培養(yǎng)特性：

大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。最適生長(zhǎng)溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍15-46℃。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有3種菌落形態(tài)：光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤(rùn)、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；黏液型：常為含有莢膜的菌株。

食品中大腸菌群數(shù)是以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（MPN）表示。大腸菌群數(shù)的定義P142GB/T

4789.3-2010大腸菌群初發(fā)酵復(fù)發(fā)酵24

±

2h

~48

±

2h大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法操作步驟實(shí)驗(yàn)材料檢測(cè)樣品：奶粉

設(shè)備和材料：恒溫培養(yǎng)箱、天平、搖床、無菌移液管（1ml）、無菌錐形瓶、無菌試管、小倒管、精密pH試紙

培養(yǎng)基和試劑：LST肉湯、BGLB肉湯、無菌生理鹽水、1mol/L

NaOH、1mol/LHCl實(shí)驗(yàn)步驟：前期準(zhǔn)備

每個(gè)小組準(zhǔn)備器材：移液管1mlX6、10mlX2、錐形瓶500mlX2、試管X14準(zhǔn)備試劑：配制：LST肉湯（1000ml）和BGLB肉湯 生理鹽水（500ml）相關(guān)配方相關(guān)配方生理鹽水：8.5g+1000ml蒸餾水（一錐形瓶瓶裝

225ml，剩下的裝在另外一個(gè)錐形瓶中）將相關(guān)玻璃儀器進(jìn)行滅菌前包裝將配制好的LST肉湯加入試管中（注意1），然后小心將小倒管放入肉湯中（注意2）（每組10支）

將所有東西包扎好放入滅菌鍋中滅菌20min實(shí)驗(yàn)步驟：前期準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)步驟：檢樣稀釋

稱取25g樣品→加入225ml生理鹽水中→搖床勻質(zhì)→制成1:10樣品勻液取一支無菌試管+9ml生理鹽水→+1ml1:10樣品→制成1:100稀釋液如2方法制成1:1000稀釋液（注意3）分別標(biāo)注好標(biāo)號(hào)實(shí)驗(yàn)步驟：初發(fā)酵用1ml無菌移液管分別吸取3個(gè)稀釋度的稀釋樣品至LST肉湯發(fā)酵試管中（每一稀釋度3管）加好后塞好試管塞，放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h實(shí)驗(yàn)步驟：復(fù)發(fā)酵將LTS發(fā)酵管取出，觀察倒管是否有氣泡，將初發(fā)酵產(chǎn)氣的管數(shù)種類進(jìn)行記錄注意：在發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。袝r(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟：復(fù)發(fā)酵與結(jié)果準(zhǔn)備BGLB肉湯發(fā)酵管（分裝、滅菌等）

用接種環(huán)接一環(huán)產(chǎn)氣的LTS發(fā)酵管至BGLB發(fā)酵管中，并記號(hào)放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h

取出觀察倒管是否產(chǎn)氣，如果兩種發(fā)酵管均產(chǎn)氣則證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性，并根據(jù)管數(shù)查MPN檢測(cè)表（P142-143），得出MPN值大腸菌群測(cè)定——MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說明MPN檢索表：MPN

為最大可能數(shù)(Most

ProbableNumber)的簡(jiǎn)稱。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。

LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持

滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長(zhǎng)，這個(gè)緩沖蛋白胨乳

糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow

lactose

fermentations）”來

促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。