微小亞歷山大藻產(chǎn)毒特性研究

微小亞歷山大藻產(chǎn)毒特性研究

從20世紀(jì)開始，赤潮在世界范圍內(nèi)頻繁發(fā)生，直接或間接地影響著漁業(yè)、沿海旅游業(yè)和食品安全，損害了海洋生態(tài)系統(tǒng)。赤潮毒素中麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)是已知對人類生命健康構(gòu)成威脅的海洋藻毒素中影響最大、分布最廣泛、危害最大的一種。亞歷山大藻作為PSP重要產(chǎn)毒藻,與大多數(shù)麻痹性中毒事件密切相關(guān)。隨著近年我國沿海經(jīng)濟的發(fā)展,近海水體污染日趨嚴(yán)重,亞歷山大藻在近岸水體和底泥中經(jīng)常出現(xiàn)。微小亞歷山大藻是我國沿海有毒甲藻中PSP的主要產(chǎn)毒藻之一,其生長和毒性受到各種環(huán)境因子的影響,其中N、P營養(yǎng)鹽的影響最為顯著。N、P營養(yǎng)鹽對亞歷山大藻產(chǎn)毒影響的早期研究,集中在對營養(yǎng)鹽的濃度及種類做一定調(diào)整,改變藻的培養(yǎng)因子,進行一代培養(yǎng)及檢測產(chǎn)毒情況。實際海水中的N、P營養(yǎng)鹽濃度和比例是動態(tài)變化的,而微小亞歷山大藻對N營養(yǎng)鹽和P營養(yǎng)鹽的利用狀況相關(guān)并相互作用。到目前為止,還很少見有關(guān)微小亞歷山大藻在N多P少或P多N少的情況下,即N、P比例失調(diào)條件下,產(chǎn)毒能力隨世代增加的變化規(guī)律。本文通過調(diào)整N、P比例,研究了當(dāng)一種營養(yǎng)鹽成為制約因素時,其對亞歷山大藻產(chǎn)毒做何影響。改變藻的培養(yǎng)條件并且連續(xù)進行了三個世代的培養(yǎng),研究長期N、P比例失調(diào)的培養(yǎng)條件,對微小亞歷山大藻產(chǎn)毒能力的影響隨藻世代增加的累積效果。并且動態(tài)跟蹤了每個世代前后,培養(yǎng)基中N、P濃度的變化,分析產(chǎn)毒藻對N、P營養(yǎng)鹽的吸收情況,將不同比例下藻對N、P吸收量的變化與藻細胞產(chǎn)毒能力做了對照分析。1材料和方法1.1陳海水來源及其分布實驗用微小亞歷山大藻(Alexandriumminutum),由近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點實驗室海洋微型生物保種中心(CCMBP)提供,培養(yǎng)基為f/2的改良配方,其中陳海水來源為東海自然海水,由國家海洋局東海監(jiān)測中心提供,pH值為8.1±0.1,鹽度為25±1。培養(yǎng)溫度為21℃,光周期L∶D=12h∶12h。用于毒素分析的4種PSP標(biāo)準(zhǔn)樣品(GTX14,GTX23,C12,STX)均網(wǎng)購自加拿大海洋生物研究所(NationalResearchCouncilofCanada,NRCC)。1.2實驗方法1.2.1n、p營養(yǎng)鹽比例以f/2培養(yǎng)基中N、P營養(yǎng)鹽比例為基準(zhǔn)進行調(diào)整,設(shè)定1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10;1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1,20個不同比例N、P營養(yǎng)鹽比例(其中NO3-N的單位濃度為54.7mg/L、總磷(TP)的單位濃度為3.42mg/L,氮源:NaNO3,磷源:NaH2PO4·H2O)對微小亞歷山大藻培養(yǎng)。為研究不同N、P濃度比例培養(yǎng)的累計效應(yīng),進行了20個N、P比例進行了連續(xù)三個世代的培養(yǎng),培養(yǎng)周期為25d,每3d取一次樣計數(shù),采用魯哥氏液固定后顯微鏡平板計數(shù)法,每次取樣設(shè)三個重復(fù),進行生長曲線的繪制,并在細胞濃度最大時,對藻液產(chǎn)毒情況進行定性定量分析。1.2.2提取并分離純度國外的毒素(1)pvc萃取產(chǎn)物mL新鮮藻液,經(jīng)探針式超聲破碎5min,鏡檢確定細胞壁已破碎,離心取上清液,添加5mL0.0lmol乙酸溶液,沸水浴萃取10min,離心后得上清液,為PSP粗萃取產(chǎn)物。(2)a型毒分離液s1取PSP粗萃取物過C18柱,所得毒素分離液主要含GTX14、STX。C18柱分離液再過陽離子交換柱純化分離,所得毒素分離液主要含C12。再加0.3mol/LNaCl淋洗陽離子交換柱,所得洗脫液主要含GTX23。(3)ch品種、配合物的ph值,5.3moolh4的降解0.03mol/LHIO4,0.3mol/lCH3COONH4,0.3mol/LNa2HPO4,按1∶1∶1比例配成,調(diào)節(jié)pH=8.3,室溫氧化15min后上機分析。1.2.3熒光分離器ro實驗分析方法參考柱前衍生高效液相色譜AOAC官方分析方法,并對分析條件優(yōu)化調(diào)整。儀器為島津公司的LC-10Avp系統(tǒng),采用WatersC18反相柱:319mm×150mm、柱溫40℃,流速1.0mL/min。梯度洗脫方法:流動相A:0.1mol/L甲酸胺;流動相B:0.1mol/L甲酸胺5%乙腈水溶液;均用冰乙酸調(diào)整pH為5.5。走峰時間15min,洗脫梯度為:0～5minBconv.5%;5～9minBconv.70%,9～13minBconv.30%,13～15minBconv.5%。熒光檢測器激發(fā)波長為340nm、發(fā)射波長為390nm。進樣量為100μL、出峰時間集中在3～6min,8～10min。1.2.4兩種吸收量的測定實驗過程中分別測定了微小亞歷山大藻三個生長周期前后的培養(yǎng)基中N、P濃度,從而得到微小亞歷山大藻對二者吸收量的變化。主要測定了NO3-N、NO2-N、NH4-N、TP四個指標(biāo),由于投放的N營養(yǎng)鹽都是以硝態(tài)N存在的,且均未檢測到NH4-N存在,NO2-N的量比NO3-N低了3個數(shù)量級以上,因此,認定NO3-N的吸收量為微小亞歷山大藻對N的吸收量。2結(jié)果與討論2.1產(chǎn)毒能力分析幾種PSP毒素經(jīng)過SPE柱分離后,主峰出峰時間可以明顯分離開來,均檢測到有GTX14、GTX23、C12、STX產(chǎn)生,但其產(chǎn)毒種類和毒素組成比例無固定規(guī)律,本文主要以PSP產(chǎn)生總量(pg/cell)作為產(chǎn)毒能力的衡量指標(biāo)。不同N,P比例培養(yǎng)的3代微小亞歷山大藻產(chǎn)毒總量的分布情況如表1所示。2.2藻n、p的吸收曲線N,P比例變化時,隨TP濃度變大,3代微小亞歷山大藻P,N的吸收情況,如圖1所示,隨TN濃度變大,3代微小亞歷山大藻N、P的吸收情況,如圖2所示。以上曲線可以看出,微小亞歷山大藻在P過量時,隨著TP濃度的線性增加,其吸收量成比例增加,而對N的吸收量呈曲線波動,反之,在N過量時,N的吸收量亦成比例增加,而對P的吸收量呈曲線波動?？芍环N營養(yǎng)鹽濃度的線性升高,其吸收量隨之成比例增長,但不能促進或抑制對另一種營養(yǎng)鹽的吸收率。2.3生物處理對藻體產(chǎn)毒能力的影響20個不同N,P比例下,3代微小亞歷山大藻產(chǎn)毒能力變化,如圖3所示,并通過三代平均的產(chǎn)毒情況,反映微小亞歷山大藻產(chǎn)毒能力隨N、P比例調(diào)整,總體的產(chǎn)毒變化趨勢。由三代平均藻細胞產(chǎn)毒能力曲線可看出,微小亞歷山大藻在N、P比例變化時,仍然能正常生長產(chǎn)毒,三代培養(yǎng)具有一定重現(xiàn)性。隨N、P比例的不同,產(chǎn)毒能力均呈現(xiàn)曲線形式波動;通過比較三代藻細胞產(chǎn)毒能力曲線可看出,微小亞歷山大藻在N、P比為1∶4、4∶1時,產(chǎn)毒能力較強,隨藻世代增加,產(chǎn)毒變化的累積效應(yīng)變緩和,產(chǎn)毒能力整體隨世代增加變?nèi)酢＝Y(jié)合前面產(chǎn)毒藻對N、P吸收情況的分析,藻對過量營養(yǎng)鹽的吸收量隨濃度增加而線性增加,對不足量的營養(yǎng)鹽的吸收量呈現(xiàn)曲線變化,同時其產(chǎn)毒情況亦為曲線變化,可推斷,當(dāng)N、P比例失調(diào)時,量不足的營養(yǎng)鹽為制約性因素,直接影響藻的產(chǎn)毒能力。2.4營養(yǎng)鹽對小球藻產(chǎn)毒能力的影響為深入探索藻細胞產(chǎn)毒變化與制約性營養(yǎng)鹽吸收量的關(guān)系,下圖將二者關(guān)系進行了對照,并做了相關(guān)性分析,其中對營養(yǎng)鹽吸收量、產(chǎn)毒能力,均指三代平均水平,如圖4和圖5所示。經(jīng)SPSS軟件計算,得出圖4兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)為0.145,圖5相關(guān)系數(shù)為0.396。結(jié)果表明對兩種制約性營養(yǎng)鹽的吸收,同藻的產(chǎn)毒能力均呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系。既吸收量越多,產(chǎn)毒能力越強,但相關(guān)關(guān)系不明顯,一定原因上由于兩者數(shù)據(jù)的數(shù)量級差別較大,其變化趨勢無法嚴(yán)格對應(yīng),同時藻的產(chǎn)毒受很多環(huán)境影響因子的影響,無法完全消除其他因素如細菌類微生物的干擾。具體的機理,還有待在以后的研究里,進一步探索。影響亞歷山大藻生長,產(chǎn)毒的環(huán)境因子較復(fù)雜,本次研究主要針對營養(yǎng)鹽方面,對微小亞歷山大藻在N、P失調(diào)時產(chǎn)毒變化情況進行了初步探索。主要得出以下結(jié)論:(1)微小亞歷山大藻在N、P失調(diào)的培養(yǎng)條件下,仍然能在一定時間內(nèi)穩(wěn)定地的生長產(chǎn)毒,隨N、P比例的線形變化,產(chǎn)毒能力呈現(xiàn)曲線形式波動。(2)當(dāng)一種營養(yǎng)鹽過量時,投放量相對不足的營養(yǎng)鹽成為影響產(chǎn)毒的制約性因素,其吸收量同細胞產(chǎn)