顯微攝影基礎(chǔ)知識(shí)

第一章顯微攝影的準(zhǔn)備和觀察一．顯微攝影裝置1．適合顯微攝影的顯微鏡(1)照相目鏡筒要能承受住顯微攝影裝置的重量。(2)通過(guò)雙目鏡筒，能對(duì)圖象進(jìn)行對(duì)焦。(3)使用光路選擇移動(dòng)桿（OpticalPathSelector），能將光亮調(diào)到適合標(biāo)本需要的強(qiáng)度。(4)物鏡要有高分辨率和良好的平場(chǎng)性（整個(gè)圓形視場(chǎng)圖象都在一個(gè)平面上）。(5)載物臺(tái)能夠移動(dòng)。(6)聚光鏡帶有孔徑光闌和調(diào)節(jié)光軸中心的機(jī)構(gòu)。(7)顯微鏡要有視場(chǎng)光闌。(8)光源要保證有足夠的亮度，可以按照觀察和攝影的需要來(lái)調(diào)節(jié)光亮強(qiáng)度。物鏡從低倍到高倍變化時(shí)，要求光亮度都能均勻。(9)要能夠安裝濾色鏡。2．適合顯微攝影的顯微攝影裝置(1）顯微攝影裝置一般有：A.手控曝光顯微攝影裝置：包括專(zhuān)為顯微攝影用的不帶鏡頭的鏡箱。需要目測(cè)或測(cè)光表，測(cè)出光值后，先推出正確的曝光時(shí)間，再進(jìn)行手控曝光。如OLYMPUS老型號(hào)的PM-6，PM-10-35和測(cè)光表EMM-7。B.單鏡頭反光鏡箱顯微攝影裝置。如OLYMPUSOM系列，鏡箱內(nèi)有內(nèi)測(cè)光系統(tǒng)，可以自動(dòng)曝光。C.自動(dòng)曝光顯微攝影專(zhuān)用裝置。具有自動(dòng)卷片、自動(dòng)測(cè)光、自動(dòng)控制曝光以及測(cè)量色溫和倒易律失效的補(bǔ)償?shù)裙δ堋Ｈ鏞LYMPUSPM-10-AD系列，PM20/30系列。(2）顯微感光記錄的方式一般有：A.35毫米卷片照相記錄。B.120卷片照相記錄。C.4X5英寸，大畫(huà)面單頁(yè)片照相記錄。D.31/4X41/4英寸、4X5英寸等尺寸規(guī)格的一步成象（PolaroidFilm）的照相記錄。E.16毫米的電影攝影記錄。需要注意的一點(diǎn)是：只要有合適的顯微鏡照相連接器（附有觀察、取景裝置），不論是生物顯微鏡、臨床顯微鏡、倒置顯微鏡還是體視（解剖）顯微鏡等，都可以把適合的照相機(jī)機(jī)身或電影攝影機(jī)機(jī)身連接起來(lái)，進(jìn)行觀察、選視野、照相或拍電影。（3）適合顯微攝影的顯微攝影裝置A.要有能夠連接顯微照相機(jī)附件的裝置，如35mm照相機(jī)后背或大畫(huà)面底片暗盒。B.能按照攝影中需要的不同光亮條件進(jìn)行光路調(diào)節(jié)。C.能夠?qū)?biāo)本不同的面積進(jìn)行測(cè)光（對(duì)30%面積的平均測(cè)光，或?qū)?%、0.1%面積的點(diǎn)測(cè)光）。D.能夠把照相機(jī)附件牢固地固定在顯微鏡上。E.可連接色溫測(cè)定的裝置。F.ISO/ASA感光度要有廣泛的選擇范圍。G.要有倒易律失效補(bǔ)償裝置，可以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的自動(dòng)曝光。H.要能夠根據(jù)標(biāo)本的具體情況，進(jìn)行曝光量的調(diào)節(jié)。I.要能夠進(jìn)行手動(dòng)曝光。J.要能裝配特殊用途的裝置，如拍16mm電影或35mm膠片的定使定格攝影（在此情況下，還應(yīng)有專(zhuān)門(mén)的曝光控制裝置）。K.控制器內(nèi)要裝有自動(dòng)曝光鎖機(jī)構(gòu)3．不同型號(hào)的顯微攝影裝置與其功能顯微攝影的裝置種類(lèi)甚多，從幀幅的大小，可分為135型、4”X5”或6”X9”型幾種；從控制系統(tǒng)的操作，可分為自控、半自動(dòng)及全自動(dòng)控制三種類(lèi)型。135型（即35mm膠片照相機(jī)）操作方便；4”X5”或6”X9”大幀幅照片操作時(shí)則較麻煩，但它拍出照片的細(xì)微結(jié)構(gòu)的清晰度則優(yōu)于135型；從控制系統(tǒng)來(lái)看，手控式較難掌握曝光時(shí)間；半自動(dòng)則可測(cè)出準(zhǔn)確的曝光時(shí)間以及光源的色溫，但仍不能滿(mǎn)足多功能的要求；高級(jí)的顯微攝影系統(tǒng)為全自動(dòng)控制，功能齊全，是研究用顯微鏡的理想顯微攝影裝置。4．顯微鏡的安放與顯微鏡室的布置顯微鏡是精密儀器，但只要正確使用，注意維護(hù)保養(yǎng)一般不會(huì)出現(xiàn)故障。用于顯微攝影的顯微鏡更需要注意以下幾點(diǎn)：(1)顯微鏡不要離機(jī)械設(shè)備或機(jī)器太近，也不要放置在經(jīng)常有人走過(guò)的地方，以免外界的震動(dòng)使底片上的圖象模糊。(2)顯微鏡不要靠近窗戶(hù)。因?yàn)閺拇皯?hù)射入的亮光影響了聚焦的準(zhǔn)確性。(3)放置顯微鏡的工作室不要太亮，否則反射光和照明的眩光透過(guò)目鏡會(huì)反射到底片上感光。(4)顯微鏡不要放置于有灰塵和骯臟的房間，并注意清潔顯微鏡。5．適合顯微鏡攝影用的物鏡與照相目鏡顯微攝影需要有高分辨率、廣視野平場(chǎng)的物鏡。不論哪個(gè)廠家的顯微鏡，在選擇顯微攝影用物鏡時(shí)都要注意此點(diǎn)。消色差物鏡不適合顯微攝影，它本身會(huì)引起視場(chǎng)圖象的邊緣焦點(diǎn)不實(shí)，而呈現(xiàn)模糊的現(xiàn)象。這是由其本身的性能引起的。如果改用平場(chǎng)消色差物鏡就可得到全視場(chǎng)清晰而平坦的圖象。所以在顯微攝影時(shí)必須選用平場(chǎng)消色差物鏡和平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡。不僅如此，顯微照片的細(xì)微結(jié)構(gòu)和層次的優(yōu)劣，也取決于物鏡的分辨率。在進(jìn)行高倍（40X）干燥系物鏡的顯微攝影時(shí)，最好采用帶校正環(huán)物鏡，因高倍干燥系物鏡的成象質(zhì)量與蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度有關(guān)，蓋玻片的厚度不符合標(biāo)準(zhǔn)，將造成覆蓋差而影響顯微攝影的質(zhì)量。在暗場(chǎng)、投射式熒光及油顯微照相時(shí)，應(yīng)選用帶虹彩光闌的物鏡，借調(diào)節(jié)光闌的大小，達(dá)到最佳的圖象對(duì)比度。有些被檢物體不能應(yīng)用蓋玻片，應(yīng)選用無(wú)罩物鏡。另外在進(jìn)行油浸熒光顯微照相時(shí)，應(yīng)使用無(wú)熒光油。照相目鏡的作用是為物鏡的色差、象差做光學(xué)補(bǔ)償，使投射到感光底片上的圖象，四周與中心都盡可能在一個(gè)焦點(diǎn)平面上。因此，正確選用生產(chǎn)廠家推薦的照相目鏡，是十分重要的。6．聚光鏡的選擇聚光鏡在顯微攝影中的作用很大，它不僅是將光源投射來(lái)的光有效地聚焦到被檢物體上，更重要的是產(chǎn)生與物鏡相適應(yīng)的光束使圖象的反差和焦深處在最佳狀態(tài)。這些條件的獲得，是以調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌從而使聚光鏡的數(shù)值孔徑與所用物鏡數(shù)值孔徑達(dá)到對(duì)應(yīng)關(guān)系。根據(jù)使用的意圖，可準(zhǔn)備幾種不同的聚光鏡。特別在使用超低倍物鏡，如1X、2X和4X時(shí)，視場(chǎng)邊緣往往發(fā)生光亮不均勻或光亮不足的缺陷，因而必須有超低倍的聚光鏡與物鏡組配。二．濾色鏡在顯微攝影中的作用濾色鏡又稱(chēng)濾光鏡，它在顯微鏡的鏡檢和顯微照相種的作用是不可忽視的。合理的選用濾色鏡能提高圖象的襯度、分辨率和增強(qiáng)反差；在彩色顯微照相中，能調(diào)節(jié)光源的色溫。1．濾色鏡的種類(lèi)與功能濾色鏡為有色玻璃（或有色膠摸）制成的透明鏡片。濾色鏡有各種各樣，種類(lèi)很多，性能不一。所以，很好地了解性能，選用符合照相目的的濾色鏡，是拍好照片的關(guān)鍵。(1)色溫轉(zhuǎn)換濾色鏡這是在拍攝彩色照片時(shí)，為了使顯微鏡光源的色溫與膠片本身要求的色溫相符合（色溫轉(zhuǎn)換）而使用的濾色鏡。燈光型彩色片選用LBT濾色鏡，日光型彩色片選用LBD-2濾色鏡。如果色溫轉(zhuǎn)換得不合適，就不能很好地使彩色還原。(2)中灰ND濾色鏡（NeutralDensityFilter）這是一種不改變色溫而減少照明的光量，并能使曝光時(shí)間延長(zhǎng)的濾色鏡。ND25僅允許25%的光量透過(guò)，阻止75%的光量通過(guò)；ND50則允許50%的光量透過(guò)，阻止50%的光量通過(guò)。(3)反差濾色鏡（綠和橙黃色）這是拍攝黑白照片專(zhuān)用的。它是為了使標(biāo)本的色調(diào)與照片上的色調(diào)相一致，起著有時(shí)加強(qiáng)反差，有時(shí)減弱反差的作用。通常用綠濾色鏡（G530）或橙濾色鏡（O560）為最多。(4)彩色補(bǔ)償濾色鏡（ColorCompensatingFilter）這是為了解決彩色照相拍攝標(biāo)本顏色或背景顏色不正常時(shí)作為顏色補(bǔ)償用的一種濾色鏡。(5)銣鐠濾色鏡（OLYMPUS用FF表示）這是在拍攝彩色照片時(shí)，為了加深紅顏色而使用的一種濾色鏡(6)吸熱濾色鏡這是在拍攝生物標(biāo)本時(shí)，吸收來(lái)自光源的紅外線(xiàn)，為避免因熱輻射而使生物標(biāo)本（如活細(xì)胞等）死亡而使用的一種濾色鏡。濾色鏡本身帶有一種很淺的顏色，所以在拍攝彩色照片時(shí)顏色會(huì)發(fā)生變化，需要加彩色補(bǔ)償濾色鏡（CC10Y或CC10M）。2．光源的色溫及色溫平衡濾色鏡光源的色溫，即光源的放射能，它是由波長(zhǎng)來(lái)表現(xiàn)的，也就是由光的顏色來(lái)表現(xiàn)的。色溫以“°K”作單位，是以標(biāo)準(zhǔn)黑體的絕對(duì)溫度為起點(diǎn)，每升高1°C為1°K。這里必須明確，在照相上光源色溫的應(yīng)用是指光線(xiàn)中所含顏色的成分，而不是指光線(xiàn)中冷熱的溫度。日光的色溫為5500~6000°K，即指日光與標(biāo)準(zhǔn)黑體在5500~6000絕對(duì)溫度時(shí)發(fā)出的光一樣。彩色膠片在很多情況下，是以日光下進(jìn)行攝影作為前提而制造出來(lái)的。換句話(huà)說(shuō)，如果不與日光相同的色溫進(jìn)行彩色進(jìn)行彩色攝影，則就不能得到正確的顏色還原。顯微鏡的照明光源多為低壓鎢絲燈和鹵素?zé)簦罢叩纳珳貫?600~3000°K，后者為3000~3400°K左右，隨電壓的升高，色溫亦隨之升高。由于鎢絲燈與鹵素?zé)舻纳珳嘏c日光相差很多，因此，顯微攝影時(shí)必須設(shè)法把燈光的色溫轉(zhuǎn)換成日光的色溫。通常使用兩種方法：(1)選擇功率高的照明光源如12V100W的鹵素?zé)?，以獲得較接近日光的色溫。(2)使用濾色鏡改變光源的色溫，用于此目的的濾色鏡叫做色溫轉(zhuǎn)換濾色鏡。請(qǐng)注意，應(yīng)用色溫轉(zhuǎn)換濾色鏡，在顯微攝影中非常重要。如果需要知道色溫的確切數(shù)值，可通過(guò)色溫計(jì)測(cè)定如OLYMPUSPM-CTR。第二章進(jìn)行顯微攝影一．顯微攝影的基礎(chǔ)知識(shí)1．顯微攝影裝置的放大倍率照片的放大倍率，決定于照相目鏡的型號(hào)和顯微攝影裝置的投影長(zhǎng)度。如前所述，目前光學(xué)顯微鏡的光路系統(tǒng)是萬(wàn)能無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)校正系統(tǒng)，與以前的有限遠(yuǎn)光學(xué)校正系統(tǒng)有了很大的改進(jìn)。所以?xún)煞N系統(tǒng)的照片放大倍率計(jì)算方法不同。(1)有限遠(yuǎn)光學(xué)校正系統(tǒng)：照片總放大倍率=物鏡放大倍率X照相目鏡放大倍率（沒(méi)有中間附件時(shí)）或照片總放大倍率=物鏡放大倍率X照相目鏡放大倍率X中間附件系數(shù)（連接有中間附件時(shí)）。(2)萬(wàn)能無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)校正系統(tǒng)：照片總放大倍率=物鏡放大倍率X照相目鏡放大倍率（中間附件不影響放大倍率）。(3)大版照相：照片總放大倍率=物鏡放大倍率X照相目鏡放大倍率X3。照片的總放大倍率是指底片上圖象的放大倍率，而不是指底片沖洗到相紙后的放大倍率。2．物鏡與目鏡的不同組合，得到的分辨率不同即使照片的總放大倍率相同，它的分辨率是根據(jù)物鏡、目鏡的不同組合而不同的。在顯微攝影時(shí)應(yīng)盡量使用低倍照相目鏡與高倍物鏡組合，這就樣能改進(jìn)底片平面象的分辨率。3．標(biāo)本畫(huà)面的構(gòu)圖顯微攝影時(shí)，視場(chǎng)中的標(biāo)本往往不適合攝影構(gòu)圖，克服這個(gè)問(wèn)題的辦法是轉(zhuǎn)動(dòng)照相機(jī)，以使標(biāo)本成比例得適合構(gòu)圖的要求。但這時(shí)要進(jìn)行操作顯微鏡來(lái)適合攝影構(gòu)圖就更困難了。一般人們樂(lè)用的方法是轉(zhuǎn)動(dòng)載物臺(tái)，將標(biāo)本調(diào)到畫(huà)幅理想的構(gòu)圖中。二．顯微攝影技術(shù)1．工作前的準(zhǔn)備(1)光路系統(tǒng)的清潔顯微攝影必須保證光路系統(tǒng)的清潔，任何光學(xué)部件有了污垢及灰塵，均會(huì)影響照片的質(zhì)量。物鏡、目鏡及聚光鏡等部件，如污垢長(zhǎng)期得不到清理，還會(huì)引起霉菌的生長(zhǎng)，致使不能應(yīng)用。各部件在擦拭時(shí)，只能清理表面，而不應(yīng)任意拆卸。(2)光軸中心的調(diào)整顯微攝影時(shí)光軸中心的調(diào)整是絕對(duì)不可忽視的，否則拍出的圖象，各部分的感光不勻。關(guān)于調(diào)整的方法前已述及，這里不予重復(fù)。(3)其它準(zhǔn)備工作檢查鏡體與照相系統(tǒng)的安裝是否正確；根據(jù)被檢物體的情況選用何種感光片；如為半自動(dòng)和全自動(dòng)照相系統(tǒng)，需調(diào)節(jié)好相應(yīng)的按鈕。拍攝前需用觀察目鏡觀察，先調(diào)好兩眼的瞳距，使兩個(gè)視場(chǎng)的象合而為一，再調(diào)節(jié)好兩眼的屈光度以適應(yīng)觀察者的視力。2．視場(chǎng)光闌與孔徑光闌的應(yīng)用視場(chǎng)光闌的作用前已述及，在觀察時(shí)根據(jù)物鏡的倍率不同視場(chǎng)光闌開(kāi)大或縮小而給予相應(yīng)的光束面積，以達(dá)到鏡檢的優(yōu)良效果。在顯微攝影時(shí)它起著增加和減弱影象反差的作用。當(dāng)視場(chǎng)光闌開(kāi)大到一定程度時(shí)，照射到被攝物體上的光，即會(huì)產(chǎn)生反射與不規(guī)則的散射，造成影象反差的損失；當(dāng)視場(chǎng)光闌收縮到取景框邊緣的外方時(shí)，圖象的反差就得到改善；視場(chǎng)光闌過(guò)度的收縮接近取景框，則圖象的四角部分將被切去。因此，在顯微攝影時(shí)，視場(chǎng)光闌的應(yīng)用是重要的一個(gè)因素，應(yīng)開(kāi)啟到比取景框稍大的位置。3．人眼屈光度的校正鏡檢時(shí)，每人眼睛的屈光度不盡都一致，總是存在著一定的差別。當(dāng)甲看清視場(chǎng)中的圖象后，乙來(lái)觀察時(shí)就不一定清晰，這是由于兩人眼睛的屈光度有所不同而造成的，這一差別很易解決，只要調(diào)節(jié)一下微調(diào)焦旋鈕就很容易使圖象清晰。但是在顯微攝影時(shí)，用這種方法是不能解決的，因?yàn)樯鲜鍪峭ㄟ^(guò)改變工作距離的長(zhǎng)短來(lái)補(bǔ)償兩人的屈光度；而顯微攝影則必須使物鏡處于它本身的工作距離處，使成象清晰地落在感光片的平面處，才能使感光片得到清晰的圖象。往往有這樣的經(jīng)驗(yàn)，在視場(chǎng)中觀察到的圖象很滿(mǎn)意，可拍攝出來(lái)的底片則模糊不清，就是這個(gè)原因。顯微攝影的調(diào)焦方法，必須利用取景側(cè)目鏡（聚焦望遠(yuǎn)鏡）或取景目鏡，首先進(jìn)行屈光度的校正，即旋轉(zhuǎn)取景側(cè)目鏡或取景目鏡上的圓環(huán)，使取景框中的雙十字線(xiàn)達(dá)到最清晰的程度，這時(shí)再進(jìn)行調(diào)焦使圖象清晰，便可進(jìn)行曝光。但應(yīng)指出，應(yīng)用同一只眼睛調(diào)節(jié)，不然兩眼之間也會(huì)存在屈光度的差異。在調(diào)節(jié)雙十字線(xiàn)時(shí)，應(yīng)盡快予以調(diào)整，否則長(zhǎng)時(shí)間的調(diào)整，人眼將產(chǎn)生適應(yīng)性，則不易調(diào)得準(zhǔn)確，如遇此情況，可遠(yuǎn)眺前方稍待一段時(shí)間后再進(jìn)行調(diào)節(jié)。在使用4X以下物鏡時(shí)，由于焦深較長(zhǎng)，只用取景目鏡還會(huì)發(fā)生調(diào)焦的誤差，這時(shí)可利用“聚焦放大鏡”來(lái)克服誤差。其方法是將聚焦放大鏡放在取景側(cè)目鏡或取景目鏡上，擰緊固定螺釘，再旋轉(zhuǎn)該鏡筒上的圓環(huán)，看清雙十字線(xiàn)后物象是否同時(shí)清晰，如不清晰，再進(jìn)行調(diào)節(jié)。在使用10X和20X物鏡時(shí)，當(dāng)雙十字線(xiàn)與圖象同時(shí)清晰后，用眼環(huán)視一下，看雙十字線(xiàn)與圖象是否有移動(dòng)現(xiàn)象，如果圖象不移動(dòng)，則說(shuō)明焦點(diǎn)已對(duì)準(zhǔn)；如有移動(dòng)，需用微調(diào)重新調(diào)節(jié)。4．曝光的補(bǔ)償拍攝顯微照片時(shí)，根據(jù)被攝物體組織結(jié)構(gòu)所占幀幅面積的百分比需要調(diào)節(jié)曝光補(bǔ)償。在明場(chǎng)情況下，如果組織結(jié)構(gòu)的各部分在幀幅內(nèi)均勻分布，這樣不論是平均測(cè)光還是點(diǎn)測(cè)光，都不需要曝光補(bǔ)償；若被攝物體所占的面積小或分散，則需要進(jìn)行曝光補(bǔ)償，加長(zhǎng)一些曝光時(shí)間，否則被攝物體的曝光不夠。反之，在暗場(chǎng)情況下，物象是明亮的，在曝光的補(bǔ)償上就需要減少一些曝光時(shí)間。5．感光片倒易率失效的補(bǔ)償感光片感光乳劑的曝光，有著一定的規(guī)律—倒易律，即曝光是以投射到感光片表面上光的亮度而決定得。根據(jù)這一規(guī)律，總曝光量為光的強(qiáng)度乘以時(shí)間的積。在日常的照相中，如果光圈f/8時(shí)，則曝光時(shí)間為1/125s（秒）；若將光圈縮小一檔，即縮小為5/11，則曝光時(shí)間相應(yīng)地增加一檔，即為1/60s，這樣兩者的總曝光量是相同的，當(dāng)顯影后，底片上的密度也是相同的。但當(dāng)曝光時(shí)間超過(guò)一定范圍后，則這一規(guī)律就不起作用，導(dǎo)致曝光不適和引起顏色還原的不良現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱(chēng)為“倒易律失效”（reciprocityfailure）。在顯微攝影中，不能通過(guò)聚光鏡的孔徑光闌的大小來(lái)補(bǔ)償曝光時(shí)間，否則會(huì)影響物鏡的成象質(zhì)量，只有在倒易律的范圍內(nèi)適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短曝光時(shí)間，才能獲得適當(dāng)曝光的底片及密度水平。在全自動(dòng)顯微攝影裝置的控制器上，裝有倒易律失效旋鈕，可根據(jù)不同感光片所指出的倒易律失效系數(shù)來(lái)設(shè)置，這樣在曝光時(shí)，就能自動(dòng)進(jìn)行補(bǔ)償，而獲得合適的曝光效果，在彩色顯微攝影中，對(duì)于這一規(guī)律的應(yīng)用尤為重要。三．彩色顯微攝影1.彩色感光片目前市場(chǎng)有許多各種不同類(lèi)型的彩色片，選擇合適的型號(hào)才能獲得理想的顯微攝影效果。（1）彩色感光片的分類(lèi)根據(jù)用途的不同，可分為彩色負(fù)片、彩色反轉(zhuǎn)片與彩色正片。彩色負(fù)片是經(jīng)沖洗后，形成三原色的補(bǔ)色，經(jīng)彩色相紙印放后，成為原色的圖片；彩色反轉(zhuǎn)片經(jīng)沖洗后，直接形成三原色，成為和物體顏色相同的透明正片；彩色正片不能直接用于拍攝，只能供給彩色負(fù)片翻印成彩色透明正片。根據(jù)拍照時(shí)所應(yīng)用的光源不同，彩色負(fù)片與彩色反轉(zhuǎn)片還分為日光型、燈光型以及混合型。彩色正片只是燈光型。日光型彩色片在拍照時(shí)，要求光源的色溫在5500°K左右；燈光型則要求色溫在3400°K左右；至于混合型彩色片，對(duì)色溫的要求約在4000°K左右。（2）選用彩色片的要求：a)要求感光片有高解像力，因?yàn)轱@微照片需要顯示標(biāo)本的微細(xì)結(jié)構(gòu)b)要求對(duì)組織中的同一種顏色能顯示標(biāo)本顏色間深淺的微細(xì)差別c)要求在背景不變的情況下，能真實(shí)地顯示標(biāo)本的原來(lái)顏色鑒于以上要求，適合攝影用的彩色片必須具備下面條件：a)微粒b)顏色反差好c)顏色還原好由于大部分顯微攝影是投射光的明場(chǎng)照明，因而選用感光度ISO/ASA50到100之間的彩色片，就能保證得到比較滿(mǎn)意的質(zhì)量。當(dāng)拍攝暗場(chǎng)（相襯、偏振光、熒光）時(shí)曝光時(shí)間要增加。在多數(shù)情況下，選用高感光度ISO/ASA的感光片，因?yàn)樾枰泄舛人俣瓤?。雖然影象顆粒大一些，也不會(huì)有很大的影響。2.濾色鏡在彩色攝影中的應(yīng)用顯微彩色攝影常用的濾色鏡有以下幾種(1)色溫轉(zhuǎn)換濾色鏡：用于將顯微鏡照明光源的色溫轉(zhuǎn)換成底片所要求的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)底片的不同要選用相應(yīng)的濾色鏡。(2)彩色補(bǔ)償濾色鏡（CC，ColorCompensation）：當(dāng)拍攝的彩色照片的背景不是白色而有顏色時(shí)，可參考下表選用補(bǔ)償濾色鏡校正照片所偏的顏色需要加用的彩色補(bǔ)償濾色鏡Red紅青CCCGreen綠品紅CCMBlue藍(lán)黃CCYCyan青紅CCRmagenta品紅綠CCGYellow黃藍(lán)CCB四．黑白顯微攝影1．黑白感光片由于顯微攝影所需要的拍攝條件與一般攝影不同，因而要根據(jù)攝影條件來(lái)選擇感光片。例如，生物學(xué)的標(biāo)本需要反差強(qiáng)、顆粒細(xì)的感光片，以得到清晰度高的攝影效果，這類(lèi)感光片在市場(chǎng)上是能買(mǎi)到的，如KodakPanatomicX、Agfapan25、IlfordPanF和FujiNeopanF。黑白感光片的型號(hào)很多，要使拍攝出來(lái)的照片質(zhì)量?jī)?yōu)良，必須選用合適的感光片。下表供使用中參考。標(biāo)本組織的條件選用的感光片ISO/ASA備注。普通病理學(xué)標(biāo)本染色的部分，需要得到正常反差習(xí)慣，或者是高反差的效果KoadkPanatomic-XIlfordPanFAgfapan25FujiNeopanF32502532按標(biāo)本的顏色選用不同反差效果的濾色鏡。病理學(xué)標(biāo)本組織片染色的部分以及其它部分，需要得到低反差，要求標(biāo)本外形的清晰度比其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的層次更重要KodakTechicalPan2415Agfaortho25FujiMinicopyHR-11641002532這類(lèi)感光片反差很高，而感光寬容度很窄。除非事先試拍，找出最佳曝光時(shí)間以后，再將曝光調(diào)節(jié)鈕放在±1/3檔上，這樣才能得到既不曝光過(guò)度，也不曝光不足的正常底片。暗背景的標(biāo)本組織，需要長(zhǎng)時(shí)間的曝光，才能得到正常底片的密度KodakTri-XPanAgfapan400IlfordHP5IlfordXP1FujiNeopan40040040040050-1600400用這一類(lèi)感光片，曝光時(shí)間縮短，但底片影象的顆粒就變粗了。2．濾色鏡在黑白攝影中的應(yīng)用黑白感光片沒(méi)有對(duì)色溫的要求，一般不需要色溫平衡濾色鏡和補(bǔ)償濾色鏡。應(yīng)用最多的為反差濾色鏡。反差濾色鏡用來(lái)控制黑白攝影的反差。常用的是綠色濾色鏡，但要得到最有效果的濾色鏡，還要根據(jù)標(biāo)本的特點(diǎn)來(lái)選擇?？稍鰪?qiáng)標(biāo)本顏色的濾色鏡請(qǐng)參考下表：標(biāo)本的顏色濾色鏡的顏色紅色/黃色綠色黃色/橙色藍(lán)色藍(lán)色/橙色如果要減弱標(biāo)本的反差，請(qǐng)用與標(biāo)本顏色相同的濾色鏡。例如，藍(lán)色標(biāo)本組織就用藍(lán)色濾色鏡，這可以使藍(lán)色的標(biāo)本組織反差降低。其它色依此類(lèi)推。四．OLYMPUS顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)簡(jiǎn)介OLYMPUS顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)有三種光學(xué)系統(tǒng)。1長(zhǎng)筒光學(xué)系統(tǒng)（LB）：OLYMPUSCH2、BH2顯微鏡是此種光路設(shè)計(jì)。2萬(wàn)能無(wú)限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)（UIS）：應(yīng)用在OLYMPUS最新型顯微鏡如BXIXCX等。UIS是目前最先進(jìn)的光路設(shè)計(jì)，它分體現(xiàn)了無(wú)限遠(yuǎn)校正方式的優(yōu)越性。光線(xiàn)通過(guò)物鏡后成為平行光束通過(guò)鏡筒，并在結(jié)象透鏡處折射或完成無(wú)相差的中間象。物鏡與觀察筒內(nèi)結(jié)象透鏡之間可添加光學(xué)附件，而不影響總放大倍數(shù)。另外UIS光學(xué)系統(tǒng)不需要安裝附加校正透鏡，在一切OLYMPUSBX系統(tǒng)構(gòu)成中都能得到最佳的顯微圖象。第三章顯微鏡的重要光學(xué)技術(shù)參數(shù)在鏡檢時(shí)，人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象，這就需要顯微鏡的各項(xiàng)光學(xué)技術(shù)參數(shù)達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)，并且要求在使用時(shí)，必須根據(jù)鏡檢的目的和實(shí)際情況來(lái)協(xié)調(diào)各參數(shù)的關(guān)系。只有這樣，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的性能，得到滿(mǎn)意的鏡檢效果。顯微鏡的光學(xué)技術(shù)參數(shù)包括：數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場(chǎng)寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好，它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的，在使用時(shí)，應(yīng)根據(jù)鏡檢的目的和實(shí)際情況來(lái)協(xié)調(diào)參數(shù)間的關(guān)系，但應(yīng)以保證分辨率為準(zhǔn)。一．?dāng)?shù)值孔徑數(shù)值孔徑簡(jiǎn)寫(xiě)NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷兩者（尤其對(duì)物鏡而言）性能高低的重要標(biāo)志。其數(shù)值的大小，分別標(biāo)在物鏡和聚光鏡的外殼上。數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（h）和孔徑角（u）半數(shù)的正玄之乘積。用公式表示如下：NA=hsinu/2孔徑角又稱(chēng)“鏡口角”，是物鏡光軸上的物體點(diǎn)與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度?？讖浇窃酱螅M(jìn)入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點(diǎn)的距離成反比。顯微鏡觀察時(shí)，若想增大NA值，孔徑角是無(wú)法增大的，唯一的辦法是增大介質(zhì)的折射率h值?；谶@一原理，就產(chǎn)生了水浸系物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率h值大于一，NA值就能大于一。數(shù)值孔徑最大值為1.4，這個(gè)數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達(dá)到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質(zhì)，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時(shí)，聚光鏡的NA值應(yīng)等于或略大于物鏡的NA值。數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系，它幾乎決定和影響著其他各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場(chǎng)寬度與工作距離都會(huì)相應(yīng)地變小。二．分辨率分辨率又稱(chēng)“鑒別率”，“解想力”。是衡量顯微鏡性能的又一個(gè)重要技術(shù)參數(shù)。顯微鏡的分辨率用公式表示為：d=l/NA式中d為最小分辨距離；l為光線(xiàn)的波長(zhǎng)；NA為物鏡的數(shù)值孔徑?？梢?jiàn)物鏡的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長(zhǎng)兩個(gè)因素決定。NA值越大，照明光線(xiàn)波長(zhǎng)越短，則d值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即減小d值，可采取以下措施1．降低波長(zhǎng)l值，使用短波長(zhǎng)光源。2．曾大介質(zhì)h值和提高NA值（NA=hsinu/2）。3．增大孔徑角。4．增加明暗反差。三．放大率放大率就是放大倍數(shù)，是指被檢驗(yàn)物體經(jīng)物鏡放大再經(jīng)目鏡放大后，人眼所看到的最終圖象的大小對(duì)原物體大小的比值，是物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放大率越高越好，在選擇時(shí)應(yīng)首先考慮物鏡的數(shù)值孔徑。四．焦深焦深為焦點(diǎn)深度的簡(jiǎn)稱(chēng)，即在使用顯微鏡時(shí)，當(dāng)焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)某一物體時(shí)，不僅位于該點(diǎn)平面上的各點(diǎn)都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個(gè)清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系：1．焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔鏡成反比。2．焦深大，分辨率降低。3．由于低倍物鏡的景深較大，所以在低倍物鏡照相時(shí)造成困難。在顯微照相時(shí)將詳細(xì)介紹。五．視場(chǎng)直徑（Fieldofview）觀察顯微鏡時(shí)，所看到的明亮的原形范圍叫視場(chǎng)，它的大小，是由目鏡里的視場(chǎng)光闌決定的。視場(chǎng)直徑也稱(chēng)視場(chǎng)寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場(chǎng)內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍。視場(chǎng)直徑愈大，愈便于觀察。F=FN/MobF:視場(chǎng)直徑，F(xiàn)N：視場(chǎng)數(shù)，Mob:物鏡放大率。視場(chǎng)數(shù)（FieldNumber,簡(jiǎn)寫(xiě)為FN），標(biāo)刻在目鏡的鏡筒外側(cè)。由公式可看出：1．視場(chǎng)直徑與視場(chǎng)數(shù)成正比。2．增大物鏡的倍數(shù)，則視場(chǎng)直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。OLYMPUSSWH目鏡的視場(chǎng)數(shù)可達(dá)26.5,目前是世界上最大的。六．覆蓋差顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。由于蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線(xiàn)從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成響質(zhì)量。國(guó)際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17mm,許可范圍在0.16—0.18mm.,在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計(jì)算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)示的0.17,即表明該物鏡要求蓋玻片的厚度。七．工作距離工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時(shí)，被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個(gè)概念，平時(shí)習(xí)慣所說(shuō)的調(diào)焦，實(shí)際上是調(diào)節(jié)工作距離。在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。第四章顯微鏡的光學(xué)附件顯微鏡得不償失光學(xué)部件包括物鏡，目鏡，聚光鏡及照明裝置幾個(gè)部分。各光學(xué)部件都直接決定和影響光學(xué)性能的優(yōu)劣，現(xiàn)分述如下：一．物鏡物鏡是顯微鏡最重要的光學(xué)部件，利用光線(xiàn)使被檢物體第一次成象，因而直接關(guān)系和影響成象的質(zhì)量和各項(xiàng)光學(xué)技術(shù)參數(shù)，是衡量一臺(tái)顯微鏡質(zhì)量的首要標(biāo)準(zhǔn)。物鏡的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，制作精密，由于對(duì)象差的校正，金屬的物鏡筒內(nèi)由相隔一定距離并被固定的透鏡組組合而成。物鏡有許多具體的要求，如合軸,齊焦。齊焦既是在鏡檢時(shí)，當(dāng)用某一倍率的物鏡觀察圖象清晰后，在轉(zhuǎn)換另一倍率的物鏡時(shí)，其成象亦應(yīng)基本清晰，而且象的中心偏離也應(yīng)該在一定的范圍內(nèi)，也就是合軸程度。齊焦性能的優(yōu)劣和合軸程度的高低是顯微鏡質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)志，它是與物鏡的本身質(zhì)量和物鏡轉(zhuǎn)換器的精度有關(guān)。物鏡的種類(lèi)很多，可從不同的角度分類(lèi)，現(xiàn)分類(lèi)介紹。根據(jù)物鏡相差校正的程度進(jìn)行分類(lèi)，可分為：1．消色差物鏡（Achromaticobjective）:如OLYMPUSACH10X，ACH40X，ACH100XO等。這是常見(jiàn)的物鏡，外殼上常有“Ach”字樣。這類(lèi)物鏡僅能校正軸上點(diǎn)的位置色差（紅，藍(lán)二色）和球差（黃綠光）以及消除近軸點(diǎn)慧差。不能校正其它色光的色差和球差，且場(chǎng)曲很大。２．復(fù)消色差物鏡（Apochromaticobjective）:復(fù)消色差物鏡的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，透鏡采用了特種玻璃或螢石等材料制作而成，物鏡的外殼上標(biāo)有“Apo”字樣，如OLYMPUSUPLAPO系列物鏡，PLAPO系列物鏡等。參見(jiàn)圖3（FIG3）。這種物鏡不僅能校正紅綠藍(lán)三色光的色差，同時(shí)能校正紅，藍(lán)二色光的球差。由于對(duì)各種相差的校正極為完善，比響應(yīng)倍率的消色差物鏡有更大的數(shù)值孔徑，這樣不僅分辨率高，象質(zhì)量?jī)?yōu)而且也有更高的有效放大率。因此，復(fù)消色差物鏡的性能很高，適用于高級(jí)研究鏡檢和顯微照相.3．半復(fù)消色差物鏡（Semiapochromaticobjedtive）:半復(fù)消色差物鏡又稱(chēng)氟石物鏡，物鏡，物鏡的外殼上標(biāo)有“FL”字樣，如OLYMPUSUPLFL系列物鏡。在結(jié)構(gòu)上透鏡的數(shù)目比消色差物鏡多，比復(fù)消色差物鏡少，成象質(zhì)量上，遠(yuǎn)較消色差物鏡為好，接近于復(fù)消色差物鏡。參見(jiàn)圖4平場(chǎng)物鏡（Planobjective）:平場(chǎng)物鏡是在物鏡的透鏡系統(tǒng)中增加一快半月形的厚透鏡，以達(dá)到校正場(chǎng)曲的缺陷。平場(chǎng)物鏡的視場(chǎng)平坦，更適用于鏡檢和顯微照象。4．特種物鏡：所謂“特種物鏡”是在上述物鏡的基礎(chǔ)上，專(zhuān)門(mén)為達(dá)到某些特定的觀察效果而設(shè)計(jì)制造的。主要有以下幾種：（1）帶校正環(huán)物鏡（Correctioncollarobjective）:在物鏡的中部裝有環(huán)裝的調(diào)節(jié)環(huán)，當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)環(huán)時(shí)，可調(diào)節(jié)物鏡內(nèi)透鏡組之間的距離，從而校正由蓋玻片厚度不標(biāo)準(zhǔn)引起的覆蓋差。調(diào)節(jié)環(huán)上的刻度可從0.11--.023,在物鏡的外殼上也標(biāo)科有此數(shù)字，表明可校正蓋玻片從0.11—0.23mm厚度之間的誤差。如OLYMPUSUPLAPO４０Ｘ0.11—0.23mmC.C.（2）帶虹彩光闌的物鏡（Irisdiaphragmobjective）:在物鏡鏡筒內(nèi)的上部裝有虹彩光闌，外方也可以旋轉(zhuǎn)的調(diào)節(jié)環(huán)，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)可調(diào)節(jié)光闌孔徑的大小，這種結(jié)構(gòu)的物鏡是高級(jí)的油浸物鏡，它的作用是在暗視場(chǎng)鏡檢時(shí)，往往由于某些原因而使照明光線(xiàn)進(jìn)入物鏡，使視場(chǎng)背景不夠黑暗，造成鏡檢質(zhì)量的下降。這時(shí)調(diào)節(jié)光闌的大小，使背景變黑，使被檢物體更明亮，增強(qiáng)鏡檢效果。（3）相襯物鏡（Phasecontrastobjective）:這種物鏡是由于相襯鏡檢術(shù)的專(zhuān)用物鏡，其特點(diǎn)是在物鏡的后焦平面處裝有相板，如ＯＬＹＭＰＵＳＵPLFL-PH系列物鏡。（4）無(wú)罩物鏡（Nocoverobjective）:有些被檢物體，如涂抹制片等，上面不能加用蓋玻片，這樣在鏡檢時(shí)應(yīng)使用無(wú)罩物鏡，否則圖象質(zhì)量將明顯下降，特別是在高倍鏡檢時(shí)更為明顯。這種物鏡的外殼上常標(biāo)刻ＮＣ，同時(shí)在蓋玻片厚度的位置上沒(méi)有０.17的字樣，而標(biāo)刻著“０”。（5）長(zhǎng)工作距離物鏡：這種物鏡是倒置顯微鏡的專(zhuān)用物鏡，它是為了滿(mǎn)足組織培養(yǎng)，懸浮液等材料的鏡檢而設(shè)計(jì)。二．目鏡目鏡的作用是把物鏡放大的實(shí)象（中間象）再放大一便，并把物象映入觀察者的眼中，實(shí)質(zhì)上目鏡就是一個(gè)放大鏡。已知顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。因此，對(duì)于物鏡不能分辨出的結(jié)構(gòu)，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。以O(shè)LYMPUS為例，目鏡按規(guī)格來(lái)劃分可分為：1．長(zhǎng)筒目鏡：如SWHK10X，WHK10X，CWHK10X，NCWHK等等，此系列目鏡應(yīng)用于OLYMPUSCH-2，BH-2系列及CH30，CH20等顯微鏡。2．UIS新型目鏡：如WH10X，SWH10X等等，此系列目鏡是OLYMPUS最新型目鏡，應(yīng)用于OLYMPUSCX2，BX2，AX系列最新型顯微鏡。由于不同系列目鏡光學(xué)設(shè)計(jì)不同，所以不能混用。三．聚光鏡聚光鏡又名聚光器，裝在載物臺(tái)的下方。小型的顯微鏡往往無(wú)聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時(shí)，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補(bǔ)光量的不足和適當(dāng)改變從光源射來(lái)的光的性質(zhì)，而且將光線(xiàn)聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。聚光鏡的的結(jié)構(gòu)有多種，同時(shí)根據(jù)物鏡數(shù)值孔徑的大小，相應(yīng)地對(duì)聚光鏡的要求也不同。1．阿貝聚光鏡（Abbecondenser）這是由德國(guó)光學(xué)大學(xué)大師恩斯特。阿貝.(ErnstAbbe)設(shè)計(jì)。阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成，有較好的聚光能力，但是在物鏡數(shù)值孔徑高于0.60時(shí)，則色差，球差就顯示出來(lái)。因此，多用于普通顯微鏡上。2．消色差聚光鏡(Achromaticaplanaticcondenser)如OLYMPUS“U-AAC”聚光鏡：這種聚光鏡又名“消色差消球差聚光鏡”和“齊明聚光鏡”它由一系列透鏡組成，它對(duì)色差球差的校正程度很高，能得到理想的圖象，是明場(chǎng)鏡檢中質(zhì)量最高的一種聚光鏡，其N(xiāo)A值達(dá)1.4。因此，在高級(jí)研究顯微鏡常配有此種聚光鏡。它不適用于4X以下的低倍物鏡，否則照明光源不能充滿(mǎn)整個(gè)視場(chǎng)。3．搖出式聚光鏡（Swingoutcondenser）如OLYMPUS“U-SC”聚光鏡：在使用低倍物鏡時(shí)（如4X），由于視場(chǎng)大，光源所形成的光錐不能充滿(mǎn)真整個(gè)視場(chǎng)，造成視場(chǎng)邊緣部分黑暗，只中央部分被照亮。要使視場(chǎng)充滿(mǎn)照明，就需將聚光鏡的上透鏡從光路中搖出。參見(jiàn)圖7從左到右分別為：U-AAC，U-AC，U-ULCU-SC4．其它聚光鏡：聚光鏡除上述明場(chǎng)使用的類(lèi)型外，還有作特殊用圖的聚光鏡。如暗視野聚光鏡（U—DCD），相襯聚光鏡(U-PCD)，偏光聚光鏡(U-POC)，微分干涉聚光鏡等，以上聚光鏡分別適用于相應(yīng)的觀察方式。另外OLYMPUS的萬(wàn)能聚光鏡U—UCDB可以同時(shí)完成以上功能。四．顯微鏡的照明裝置顯微鏡的照明方法按其照明光束的形成，可分為“透射式照明”，和“落射式照明”兩大類(lèi)。前者適用于透明或半透明的被檢物體，絕大數(shù)生物顯微鏡屬于此類(lèi)照明法；后者則適用于非透明的被檢物體，光源來(lái)自上方，又稱(chēng)“反射式或落射式照明。主要應(yīng)用與金相顯微鏡或熒光鏡檢法。1．透射式照明透射式照明法分中心照明和斜射照明兩種形式：（1）中心照明：這是最常用的透射式照明法，其特點(diǎn)是照明光束的中軸與顯微鏡的光軸同在一條直線(xiàn)上。它又分為“臨界照明”和“柯勒照明”兩種。A．臨界照明（Criticalillumination）:這是普通的照明法。這種照明的特點(diǎn)是光源經(jīng)聚光鏡后成象在被檢物體上，光束狹而強(qiáng)，這是它的優(yōu)點(diǎn)。但是光源的燈絲象與被檢物體的平面重合，這樣就造成被檢物體的照明呈現(xiàn)出不均勻性，在有燈絲的部分則明亮；無(wú)燈絲的部分則暗淡，不僅影響成象的質(zhì)量，更不適合顯微照相，這是臨界照明的主要缺陷。其補(bǔ)救的方法是在光源的前方放置乳白和吸熱濾色片，使照明變得較為均勻和避免光源的長(zhǎng)時(shí)間的照射而損傷被檢物體。B．柯勒照明：柯勒照明克服了臨界照明的缺點(diǎn)，是研究用顯微鏡中的理想照明法。這中照明法不僅觀察效果佳，而且是成功地進(jìn)行顯微照相所必須的一種照明法。光源的燈絲經(jīng)聚光鏡及可變視場(chǎng)光闌后，燈絲象第一次落在聚光鏡孔徑的平面處，聚光鏡又將該處的后焦點(diǎn)平面處形成第二次的燈絲象。這樣在被檢物體的平面處沒(méi)有燈絲象的形成，不影響觀察。此外照明變得均勻。觀察時(shí)，可改變聚光鏡孔徑光闌的大小，使光源充滿(mǎn)不同物鏡的入射光瞳，而使聚光鏡的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑匹配。同時(shí)聚光鏡又將視場(chǎng)光闌成象在被檢物體的平面處，改變視場(chǎng)光闌的大小可控制照明范圍。此外，這種照明的熱焦點(diǎn)不在被檢物體的平面處，即使長(zhǎng)時(shí)間的照明，也不致?lián)p傷被檢物體。（2）斜射照明：這種照明光束的中軸與顯微鏡的光軸不在一直線(xiàn)上，而是與光軸形成一定的角度斜照在物體上，因此成斜射照明。相襯顯微術(shù)和暗視野顯微術(shù)就是斜射照明。2．落射式照明這種照明的光束來(lái)自物體的上方通過(guò)物鏡后射到被檢物體上，這樣物鏡又起著聚光鏡的作用。這種照明法是適用于非透明物體，如金屬，礦物等。五．顯微鏡的光軸調(diào)節(jié)在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，光源、聚光鏡、物鏡和目鏡的光軸以及光闌的中心必須與顯微鏡的光軸同在一直線(xiàn)上，所以在鏡檢前必須進(jìn)行顯微鏡光軸的調(diào)節(jié)，否則不能達(dá)到最佳觀察效果。1．光源燈絲調(diào)節(jié)：舊式顯微鏡需要調(diào)節(jié)燈泡的位置。目前的新型顯微鏡的光源已經(jīng)進(jìn)行了予定心設(shè)置，所以不需要調(diào)整。2．聚光鏡的中心調(diào)整：實(shí)際上顯微鏡光軸的調(diào)整的重點(diǎn)即是聚光鏡的位置調(diào)整。首先將視場(chǎng)光闌縮小，用10X物鏡觀察，在視場(chǎng)內(nèi)可見(jiàn)到視場(chǎng)光闌的輪廓，如果不在中央，則利用聚光鏡外側(cè)的兩個(gè)調(diào)整螺釘將其調(diào)至中央部分，當(dāng)緩慢地增大視場(chǎng)光闌時(shí)，能看到光束向視場(chǎng)周緣均勻展開(kāi)直至視場(chǎng)光闌的輪廓象完全與視場(chǎng)邊緣內(nèi)接，說(shuō)明已經(jīng)和軸。和軸后再略為增大視場(chǎng)光闌，使輪廓象剛好處于視場(chǎng)外切或略大。3．孔徑光闌的調(diào)節(jié)：孔徑光闌安裝在聚光鏡內(nèi)，研究用顯微鏡的聚光鏡的外側(cè)邊緣上都有科數(shù)及定位記號(hào)，這樣便于調(diào)節(jié)聚光鏡與物鏡的數(shù)值孔徑相匹配，原則上說(shuō)更換物鏡時(shí)需調(diào)整聚光鏡的數(shù)值孔徑，一般物鏡的數(shù)值孔徑乘0.6或0.8就是聚光鏡的數(shù)值孔徑。第五章各種顯微鏡技術(shù)介紹前面講述了顯微鏡的光學(xué)原理以及附件，下面將分類(lèi)介紹一下各類(lèi)研究用鏡檢術(shù)。在生物研究領(lǐng)域，透射式明場(chǎng)顯微鏡得到廣泛應(yīng)用，在此基礎(chǔ)上各種特殊的鏡檢方法也得到應(yīng)用，如相襯，熒光，干涉，暗場(chǎng)，這些鏡檢方法在高檔顯微鏡上均能同時(shí)實(shí)現(xiàn)，如OLYMPUSBX51,BX61等.在此將分類(lèi)介紹。第一節(jié)正立式顯微鏡一．明視野觀察（Brightfield）明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式，廣泛應(yīng)用于病理、檢驗(yàn)，用于觀察被染色的切片，所有顯微鏡均能完成此功能。在此不再贅述。OLYMPUS此類(lèi)顯微鏡有CX21/31/41等。二．暗視野觀察（Darkfield）暗視野實(shí)際是暗場(chǎng)照明發(fā)。它的特點(diǎn)和明視野不同，不直接觀察到照明的光線(xiàn)，而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線(xiàn)。因此，視場(chǎng)成為黑暗的背景，而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的象。暗視野的原理是根據(jù)光學(xué)上的丁道爾現(xiàn)象，微塵在強(qiáng)光直射通過(guò)的情況下，人眼不能觀察，這是因?yàn)閺?qiáng)光繞射造成的。若把光線(xiàn)斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了體積，為人眼可見(jiàn)。暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡。它的特點(diǎn)是不讓光束由下至上的通過(guò)被檢物體，而是將光線(xiàn)改變途徑，使其斜射向被檢物體，使照明光線(xiàn)不直接進(jìn)入物鏡，利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象。暗視野觀察的分辨率遠(yuǎn)高于明視野觀察，最高達(dá)0.02—0.004mm..三．相襯鏡檢法（Phasecontrast）在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過(guò)程中，相襯鏡檢術(shù)的發(fā)明成功，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度），對(duì)于無(wú)色通明的生物標(biāo)本，當(dāng)光線(xiàn)通過(guò)時(shí)，波長(zhǎng)和振幅變化不大，在明場(chǎng)觀察時(shí)很難觀察到標(biāo)本.相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進(jìn)行鏡檢，也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?，即使是無(wú)色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見(jiàn)。這大大便利了活體細(xì)胞的觀察，因此相襯鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡如OLYMPUSCKX31/41，IX71等等。相襯鏡檢法在裝置上與明場(chǎng)不同，有一些特殊要求：1．環(huán)狀光闌（Ringslit）:裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體---相襯聚光鏡。它是由大小不同的環(huán)形光闌裝在一圓盤(pán)內(nèi)，外面標(biāo)有10X、20X、40X、100X等字樣，與相對(duì)應(yīng)倍數(shù)的物鏡配合使用。2．相板（Phaseplate）:裝在物鏡的后焦平面處，它分為兩部分，一是通過(guò)直射光的部分，為半透明的環(huán)狀，叫共軛面；另一是通過(guò)衍射光的部分，叫“補(bǔ)償面”。有相板的物鏡稱(chēng)“相襯物鏡”，外殼上常有“Ph”字樣。相襯鏡檢法是一種比較復(fù)雜的鏡檢方法，想要得到好的觀察效果，顯微鏡的調(diào)試非常重要。除此之外還應(yīng)注意以下幾個(gè)方面。1．光源要強(qiáng)，全部開(kāi)啟孔徑光闌；2．使用濾色片，使光波近于單色；四．微分干涉稱(chēng)鏡檢術(shù)（DifferentialinterferencecontrastDIC）微分干涉鏡檢術(shù)出現(xiàn)于60年代，它不僅能觀察無(wú)色透明的物體，而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感，并具有相襯鏡檢術(shù)所不能達(dá)到的某些優(yōu)點(diǎn)，觀察效果更為逼真。1．原理微分干涉稱(chēng)鏡檢術(shù)是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來(lái)分解光束。分裂出來(lái)的光束的振動(dòng)方向相互垂直且強(qiáng)度相等，光束分別在距離很近的兩點(diǎn)上通過(guò)被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺(jué)。2．微分干涉稱(chēng)鏡檢術(shù)所需的特殊部件：（1）起偏鏡（2）檢偏鏡（3）渥拉斯頓棱鏡2塊3．微分干涉稱(chēng)鏡檢時(shí)的注意事項(xiàng)（1）因微分干涉襯靈敏度高，制片表面不能有污物和灰塵。（2）具有雙折射性的物質(zhì)，不能達(dá)到微分干涉襯鏡檢鏡檢的效果。（3）倒置顯微鏡應(yīng)用微分干涉襯時(shí)，不能用塑料培養(yǎng)皿。五熒光鏡檢術(shù)熒光鏡檢術(shù)是用短波長(zhǎng)的光線(xiàn)照射用熒光素染色過(guò)的被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光，然后觀察。熒光鏡檢術(shù)廣泛應(yīng)用于生物，醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。1．熒光鏡檢術(shù)一般分為透射和落射式兩種類(lèi)型。（1）透射式：激發(fā)光來(lái)自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發(fā)光不進(jìn)入物鏡，而使熒光進(jìn)入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時(shí)，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。（2）落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來(lái)自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對(duì)透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)視場(chǎng)的均勻照明。2．熒光鏡檢術(shù)的注意事項(xiàng)（1）激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象，因此盡可能縮短觀察時(shí)間，暫時(shí)不觀察時(shí)，應(yīng)用擋板遮蓋激發(fā)光。（2）作油鏡觀察時(shí)，應(yīng)用“無(wú)熒光油”。（3）熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進(jìn)行。（4）電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。目前許多新興生物研究領(lǐng)域應(yīng)用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交（FISH）等等。第二節(jié)偏光顯微鏡（Polarizingmicroscope）一．偏光顯微鏡的特點(diǎn)偏光顯微鏡是鑒定物質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)光學(xué)性質(zhì)的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質(zhì)，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當(dāng)然這些物質(zhì)也可用染色發(fā)來(lái)進(jìn)行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。偏光顯微鏡的特點(diǎn)，就是將普通改變?yōu)槠膺M(jìn)行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射（各向同行）或雙折射性（各向異性）。雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應(yīng)用在礦物，化學(xué)等領(lǐng)域。在生物學(xué)和植物學(xué)也有應(yīng)用。二．偏光顯微鏡的基本原理偏光顯微鏡的原理比較復(fù)雜，在此不作過(guò)多介紹,偏光顯微鏡必須具備以下附件（a）器偏鏡（b）檢偏鏡（c）專(zhuān)用無(wú)應(yīng)力物鏡（d）旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)。三．偏光鏡檢術(shù)的方式（一）正相鏡檢（Orthscope）:又稱(chēng)無(wú)畸變鏡檢，其特點(diǎn)是使用低倍物鏡，不用伯特蘭透鏡（BertrandLens）,同時(shí)為使照明孔徑變小，推開(kāi)聚光鏡的上透鏡。正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。（二）錐光鏡檢（Conoscope）：又稱(chēng)干涉鏡檢，這種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。四．偏光顯微鏡在裝置上的要求（一）光源：最好采用單色光，因?yàn)楣獾乃俣龋凵渎剩透缮娆F(xiàn)象由于波長(zhǎng)的不同而有差異。一般鏡檢可使用普通光。（二）目鏡：要帶有十字線(xiàn)的目鏡。（三）聚光鏡：為了取得平行偏光，應(yīng)使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。（四）伯特蘭透鏡：這是把物體所有造成的初級(jí)相放大為次級(jí)相的輔助透鏡。五．偏光鏡檢術(shù)的要求（一）載物臺(tái)的中心與光軸同軸。（二）起偏鏡和檢偏鏡應(yīng)處于正交位置。（三）制片不宜過(guò)薄。OLYMPUS偏光顯微鏡有BX51-P第三節(jié)倒置顯微鏡（Invertedmicroscope）前面講的是正立式顯微鏡的鏡檢方式，主要用于切片的觀察。而倒置顯微鏡是為了適應(yīng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的組織培養(yǎng)、細(xì)胞離體培養(yǎng)、浮游生物、環(huán)境保護(hù)、食品檢驗(yàn)等顯微觀察。由于上述樣品特點(diǎn)的限制，被檢物體均放置在培養(yǎng)皿（或培養(yǎng)瓶）中，這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長(zhǎng)，能直接對(duì)培養(yǎng)皿中的被檢物體進(jìn)行顯微觀察和研究。因此，物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過(guò)來(lái)，故稱(chēng)為“倒置顯微鏡”。如OLYMPUSCKX31/41，IX51，IX71等。由于工作距離的限制，倒置顯微鏡物鏡的最大放大率為60X。一般研究用倒置顯微鏡都配置有4X、10X、20X、及40X相差物鏡，因?yàn)榈怪蔑@微鏡多用于無(wú)色透明的活體觀察。如果用戶(hù)有特殊需要，也可以選配其它附件，用來(lái)完成微分干涉、熒光及簡(jiǎn)易偏光等觀察。目見(jiàn)倒置顯微鏡廣泛應(yīng)用于patch-clamp,transgeneICSI等領(lǐng)域。第四節(jié)體視顯微鏡（Stereomicroscope）體視顯微鏡又稱(chēng)“實(shí)體顯微鏡”或“解剖鏡”，是一種具有正象立體感地目視儀器，被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)林、工業(yè)及海洋生物各部門(mén)。它具有如下地特點(diǎn)：1．雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角---體視角（一般為12度---15度），因此成象具有三維立體