一種抗赤潮毒素的貝毒提取液的制備及檢測(cè)方法的建立

一種抗赤潮毒素的貝毒提取液的制備及檢測(cè)方法的建立

近年來，中國沿海潮漲頻繁。赤潮不僅破壞海洋漁業(yè)資源和生產(chǎn),惡化海洋環(huán)境,更嚴(yán)重的是,有些赤潮種類能產(chǎn)生毒素,在海產(chǎn)品體內(nèi)長期富集,當(dāng)人們食用赤潮毒素污染的海產(chǎn)品后就可能出現(xiàn)中毒現(xiàn)象甚至死亡。根據(jù)對(duì)人類的中度癥狀和機(jī)制差異可將赤潮毒素分為以下5種:麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)、腹瀉性貝毒(diarrheticshellfishpoisoning,DSP)、記憶缺失性貝毒(amnesiashellfishpoisoning,ASP)、神經(jīng)性貝毒(neurotoxicshellfishpoisoning,NSP)和西加魚毒(ciguaterafishpoisoning,CFP)。其中,PSP和DSP是我國海洋赤潮生物中最常見的2種。海產(chǎn)品繼病原菌、弧菌和病毒之后,赤潮毒素又成為威脅海產(chǎn)品質(zhì)量的另一問題。因此,對(duì)海產(chǎn)品的麻痹性貝毒進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于保證廣大消費(fèi)者健康安全有重要意義。1材料和方法1.1水產(chǎn)品市場(chǎng)市場(chǎng)樣品采自上海市幾個(gè)重要的海產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng),主要有滬西水產(chǎn)品、銅川水產(chǎn)品、曹安四平水產(chǎn)品、福山路水產(chǎn)品市場(chǎng)。采集的種類主要為貽貝、海灣扇貝、扁玉螺等常見的海產(chǎn)品,有些也是赤潮毒素敏感種類。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的制備PSP的小鼠生物檢測(cè)方法按照AOAC標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。打開貝殼,取一定量的軟組織置于勻漿器中勻漿,稱100g勻漿加入100ml0.1mol/LHCl,攪勻后調(diào)pH值為2～4。水浴煮沸5min;冷卻至室溫后再調(diào)pH為2～4,然后離心(3000r/min)5min,上清液即為貝毒提取液。取8只小鼠,稱重后,在每只腹腔內(nèi)注射1ml貝毒提取液,記錄小鼠的死亡時(shí)間。實(shí)驗(yàn)小鼠購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,測(cè)試品系為KM系雌性小鼠。所測(cè)麻痹性貝毒的毒力用100g貝類軟組織含有的鼠單位(MU)表示,1個(gè)鼠單位的定義是15min內(nèi)殺死1只20g重小鼠的腹腔注射劑量。1.3毒種毒素化合物檢測(cè)選擇幾份小鼠法已檢測(cè)有毒的樣品進(jìn)一步用HPLC檢測(cè)。PSP的檢測(cè)采用高碘酸柱前衍生化方法進(jìn)行。上述貝毒提取液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后,即可用高碘酸進(jìn)行氧化。0.3mol/LNa2HPO4、0.3mol/L甲酸銨和0.03mol/L高碘酸等體積比混合,配制高碘酸混合液。在1.5ml的Micro-Tube中加100μl的樣品或毒素標(biāo)準(zhǔn)物(pH=7)及500μl新配制的高碘酸混合液,在室溫下反應(yīng)1min,加入5μl冰醋酸以終止反應(yīng)。均勻混合后靜置10min,注射50μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)中。HPLC條件:Waters600四元梯度泵,WaterssymitryRP-18柱(4.6mm×150mm),Waters474熒光檢測(cè)器。流動(dòng)相為二元流動(dòng)相,A相為0.1mol/L的甲酸銨溶液,B相體積分?jǐn)?shù)為5%的乙腈溶液,流量為1ml/min。熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長為330nm,發(fā)射波長為390nm。毒素標(biāo)樣為GTX1/4、NEO、GTX2/3和STX。這幾種毒素化合物的檢測(cè)限為:GTX1/4,69pg;NEO,37pg;GTX2/3,40pg;STX:37pg。所用液體試劑均為色譜純。2樣品的毒力檢測(cè)小鼠法共檢測(cè)出8份樣含有PSP,這些樣品分別是5月份的海灣扇貝(2份),六月份的海灣扇貝(2份)和扁玉螺(1份),7月份的海灣扇貝(1份),10月份的海灣扇貝(1份)和扁玉螺(1份)。毒力范圍是159.81～615.66MU/100g。8和9月份樣品沒有檢測(cè)出PSP。有毒的樣品大部分采自滬西和銅川水產(chǎn)市場(chǎng)(表1)。HPLC法對(duì)5份有毒的樣品檢測(cè)表明,6和7月份的海灣扇貝樣品10月份扁玉螺樣品含有PSP毒素,其含量分別為1.94、0.48和0.19μg/100g,主要成分是GTX2/3而另外2份樣品未檢測(cè)出PSP毒素(表2)。3赤潮毒素風(fēng)險(xiǎn)PSP是一種神經(jīng)性毒素,能造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙而產(chǎn)生麻痹作用。對(duì)人體的中毒量為600～5000MU,致死量為3000～30000MU。WHO規(guī)定,100貝類可食部分的PSP毒力超過400MU(相當(dāng)于80μgSTX)時(shí)不得食用。我國的PSP的警戒標(biāo)準(zhǔn)和WHO的標(biāo)準(zhǔn)一致。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn),5月份在滬西和銅川水產(chǎn)市場(chǎng)采集的海灣扇貝樣品PSP含量都超出警戒值,應(yīng)禁止食用。其他幾份有毒樣品的PSP含量雖沒有超出警戒值,但應(yīng)少量食用或避免食用。從種類上看,有毒的海產(chǎn)品主要為海灣扇貝、扁玉螺等,這些種類貝類為赤潮毒素敏感種類,食用時(shí)應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。關(guān)于PSP,國內(nèi)也有不少報(bào)道。林燕堂等用小白鼠法對(duì)廣東沿海的PSP做了一些研究,發(fā)現(xiàn)華貴櫛孔扇貝、櫛江珧和翡翠貽貝含毒素量較高,而牡蠣、蚶和青蛤等貝類含毒素量較低。YU等利用優(yōu)化的HPLC方法對(duì)中國貝類和的PSP的檢測(cè)分析表明,連云港有一些貝類樣品,含有PSP毒素;江天久等用HPLC法對(duì)廣東大亞灣的華貴櫛孔扇貝和翡翠貽貝所含的PSP進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)2種貝類消化腺的毒素成分相同,主要為GTX5和C1/2。除上述至毒生物種類外,還有菲律賓蛤仔、紅帶織文螺和織文螺等。因此,為確保上海市海產(chǎn)品的食用安全,應(yīng)對(duì)上述生物種類進(jìn)行重點(diǎn)檢測(cè)。小白鼠生物檢測(cè)法和高效液相色譜法是檢測(cè)赤潮毒素的2種常用方法。小白鼠法相對(duì)簡單,能對(duì)所抽提的全部毒素的毒性測(cè)定,使用最為廣泛,是目前被所有實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。但小白鼠法不能測(cè)定毒素的含量和組分,而且容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。而HPLC法正好彌補(bǔ)了這些缺點(diǎn)?，F(xiàn)HPLC檢測(cè)結(jié)果也表明,引起小白鼠死亡的物質(zhì)并非都是PSP的主要成分,也可能為其他類型的有毒化合物。同時(shí),HPLC法也有一定的缺點(diǎn),那就是毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)難以全部