生物競賽生物化學(xué)33DNA復(fù)制頂級資源生物化學(xué)原理第二版

第三十三章DNA復(fù)制1整理ppt提綱DNA復(fù)制的一般特征參與DNA復(fù)制的主要酶和蛋白質(zhì)DNA復(fù)制的詳細(xì)機(jī)制以大腸桿菌為代表的細(xì)菌基因組DNA的“θ-復(fù)制〞系統(tǒng)“滾環(huán)復(fù)制〞系統(tǒng)D-環(huán)復(fù)制系統(tǒng)真核細(xì)胞的細(xì)胞核DNA復(fù)制古菌的DNA復(fù)制DNA復(fù)制的高度忠實性DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)機(jī)制2整理pptDNA復(fù)制的一般特征以原來的DNA兩條鏈作為模板，四種dNTP為前體，還需要Mg2＋作為模板的DNA需要解鏈半保存復(fù)制需要引物——主要是RNA，少數(shù)是蛋白質(zhì)復(fù)制的方向始終是5′→3′具有固定的起點(diǎn)多為雙向復(fù)制，少數(shù)為單向復(fù)制半不連續(xù)性具有高度的忠實性和進(jìn)行性3整理pptDNA復(fù)制可能的三種方式4整理ppt由Meselson和Stahl設(shè)計證明半保存復(fù)制的實驗被譽(yù)為生物學(xué)最美麗的實驗5整理pptMeselson和Stahl的證明DNA半保存復(fù)制的實驗流程6整理pptMeselson和Stahl的實驗結(jié)果7整理pptMeselson與Stalh在42年以后在最初他們相遇的一顆樹下重逢時的合影8整理pptTaylor以蠶豆根尖細(xì)胞為材料、使用放射性同位素證明真核細(xì)胞DNA也是半保存復(fù)制的實驗。9整理ppt某些生物DNA復(fù)制的引物序列

10整理ppt證明DNA復(fù)制的方向始終是5′→3′的末端終止實驗

11整理pptDNA復(fù)制起始區(qū)的特征由多個短的重復(fù)序列組成；能夠被多亞基的復(fù)制起始區(qū)結(jié)合蛋白識別；通常富含AT堿基對，這有利于DNA復(fù)制起動時的解鏈，因為AT堿基對含有的氫鍵數(shù)目低于GC堿基對。12整理ppt細(xì)菌和酵母DNA復(fù)制起始區(qū)的特征13整理ppt復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)14整理ppt電鏡下真核生物DNA的多個復(fù)制叉結(jié)構(gòu)15整理pptJohnCairns的實驗復(fù)制開始時，將大腸桿菌放在含低劑量的[3H]-dT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾分鐘；隨后，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到含高劑量的[3H]-dT的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一段時間；最后，收集細(xì)胞，小心地裂解以抽取其中的染色體DNA進(jìn)行放射自顯影。如果是單向復(fù)制，自顯影圖譜上銀顆粒的密度應(yīng)該是一端高、一端低；如果是雙向復(fù)制，那么應(yīng)該中間是一段低密度的銀顆粒，兩側(cè)是高密度的銀顆粒。低密度銀顆粒意味著這一段DNA屬于復(fù)制起始區(qū)，高密度顆粒代表的是后來合成的。16整理pptCairns證明大腸桿菌DNA雙向復(fù)制的實驗17整理pptReijiOkazaki的實驗脈沖標(biāo)記——目的在于即時標(biāo)記在特定時段內(nèi)合成的DNA。脈沖追蹤——目的那么是要弄清那些被標(biāo)記上的DNA片段后來的去向。18整理pptOkazaki的脈沖標(biāo)記和脈沖追蹤的實驗19整理pptOkazaki的脈沖標(biāo)記和脈沖追蹤的實驗結(jié)果分析20整理pptOkazaki的脈沖標(biāo)記和脈沖追蹤的實驗結(jié)果分析21整理ppt在復(fù)制叉中不連續(xù)合成的DNA片段稱為岡崎片段，連續(xù)合成的DNA子鏈被稱為前導(dǎo)鏈，不連續(xù)合成的DNA子鏈被稱為后隨鏈或滯后鏈。22整理ppt參與DNA復(fù)制的主要酶

和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能DNA聚合酶DNA解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA引發(fā)酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶DNA連接酶端聚酶〔真核生物特有〕23整理pptDNA聚合酶DNA聚合酶的全名是依賴于DNA的DNA聚合酶，就是以DNA為模板，催化DNA合成的聚合酶。DNA聚合酶是參與DNA復(fù)制的主要酶，該酶的許多性質(zhì)直接決定了DNA復(fù)制的一些根本特征。24整理pptDNA聚合酶反響通式：Mg2+DNA+引物-OH+dNTPDNA/引物-dNMP+PPi5′3′隨后的PPi迅速水解驅(qū)動反響的進(jìn)行細(xì)菌DNA聚合酶——DNApolI,II,III,IV和V真核生物DNA聚合酶——DNApolα,β,γ,δ和ε以及更多25整理pptArthurKornberg(1957)大腸桿菌細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物+DNA模板有無DNA合成??-dNTPs-Mg2+(輔助因子)-ATP(能源)-游離的3’OH端(引物)體外測定DNA復(fù)制純化得到DNA聚合酶I

目前是Standford大學(xué)醫(yī)學(xué)院的終身教授26整理ppt一條肽鏈至少具有三種不同的酶活性！不可思議!!!5′→3′外切核酸酶

3′→5′外切核酸酶5′→3′DNA聚合酶DNA聚合酶I27整理pptDNA聚合酶折疊成幾個不同的結(jié)構(gòu)域HansKlenow使用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶處理DNA聚合酶I，結(jié)果得到大小兩個片段：大片段被稱為Klenow片段或Klenow酶，含有大小兩個結(jié)構(gòu)域，其中小結(jié)構(gòu)域具有3′→5′外切酶活性，大結(jié)構(gòu)域具有5′→3′聚合酶活性；小片段只有5′→3′外切酶活性。TomSteitz等得到了Klenow酶的晶體結(jié)構(gòu)

28整理pptKlenow酶的晶體結(jié)構(gòu)模型

29整理pptDNA聚合酶I所具有的5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性的聯(lián)合使用可導(dǎo)致一個具有切口的DNA分子發(fā)生切口平移。如果在切口平移反響中參加放射性標(biāo)記的dNTP，那么放射性標(biāo)記的核苷酸會參入到重新合成的DNA鏈上，從而使DNA的一條鏈帶上同位素標(biāo)記。切口平移30整理pptDNA聚合酶I是不錯，然而….

1969年，JohnCairns等人別離到一種大腸桿菌突變株其DNA聚合酶I活性只有野生型的1%(polA基因突變)突變體對UV輻射極為敏感其他一切正常細(xì)胞照常分裂結(jié)論:DNA聚合酶I不是大腸桿菌DNA復(fù)制的主要聚合酶31整理ppt其他線索….速度太慢酶量太多進(jìn)行性不夠高——聚合酶的進(jìn)行性是指一種聚合酶從與DNA模板結(jié)合到與模板解離的這段時間內(nèi)催化參入到DNA鏈上的核苷酸數(shù)目。顯然，DNA聚合酶的進(jìn)行性越高，催化復(fù)制的效率就越高。聚合酶I的進(jìn)行性平均值為20nt~50nt，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DNA復(fù)制的實際值。結(jié)論：一定有其他DNA聚合酶。生化學(xué)家很快從polA突變體純化到新的DNA聚合酶32整理pptDNA聚合酶I的功能究竟是什么？在多種需要短DNA合成的過程中起作用在DNA修復(fù)中起主要作用在DNA復(fù)制中，去除RNA引物，并填補(bǔ)隨后留下的空缺。33整理ppt對DNA聚合酶I更多的認(rèn)識為什么具有3′→5′外切核酸酶?充當(dāng)校對的功能去除復(fù)制中錯配的核苷酸，然聚合酶有時機(jī)重新合成正確配對的核苷酸聚合酶的活性中心和3′-外切酶活性中心切換？添加堿基還是切除堿基？34整理pptDNA聚合酶的聚合和校對

35整理pptDNA聚合酶家族已在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)5種不同的DNA聚合酶DNAPI:占聚合酶總活性的90%DNAPII:在DNA修復(fù)中起作用(1999年得到證明)DNAPIII:主要的DNA復(fù)制酶DNAPIV:在DNA修復(fù)中起作用〔在1999年發(fā)現(xiàn)〕DNAPV:在DNA修復(fù)中起作用〔在1999年發(fā)現(xiàn)〕36整理pptDNA聚合酶III“真正〞的大腸桿菌DNA復(fù)制酶快：1000nt/秒/酶進(jìn)行性高：>500000nt酶量適宜精確溫度敏感型突變體——只能生存在允許溫度〔30℃〕下，當(dāng)溫度上升到限制溫度〔45℃〕時，大腸桿菌難以生存。究其原因，是因為編碼聚合酶IIIα亞基的polC基因發(fā)生了突變，致使該酶對溫度變化極為敏感。當(dāng)環(huán)境溫度超過30℃以后，就很容易變性而喪失活性，這時DNA復(fù)制不能正常進(jìn)行；而在允許溫度下，該酶的活性是正常的，DNA復(fù)制也很正常。其結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜!!!37整理ppt大腸桿菌DNA聚合酶III的亞基組成和功能分工38整理ppt大腸桿菌DNA聚合酶III的結(jié)構(gòu)模型39整理pptDNA聚合酶III全酶的滑動鉗夾住雙螺旋DNA

40整理pptDNA聚合酶I、II和III的比較性質(zhì)IIIIII結(jié)構(gòu)基因polApolBpolC分子量（k）10390130分子數(shù)/細(xì)胞40010010Vmax(參入的nt/秒)16~202~5250~10003′-外切酶活性√√√5′-外切酶活性√××進(jìn)行性（nt）3~20010000500000突變體表現(xiàn)型UV敏感、硫酸二甲酯敏感無DNA復(fù)制溫度敏感型生物功能DNA修復(fù)、RNA引物切除DNA修復(fù)染色體DNA復(fù)制41整理ppt真核細(xì)胞的DNA聚合酶已在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)至少15種以上的DNA聚合酶，除了5種發(fā)現(xiàn)較早的DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε以外，其它幾種DNA聚合酶如聚合酶θ、ζ、η、κ、ι、μ、λ、ψ和ξ都有相關(guān)的報道，這些新發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶一般缺乏3′-外切酶的活性〔θ除外〕，因此沒有校對的功能，它們主要參與DNA的跨越合成，以克服損傷對DNA復(fù)制的不利影響。42整理ppt真核細(xì)胞DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε的性質(zhì)和功能性質(zhì)DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε亞細(xì)胞定位細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體基質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核引發(fā)酶活性有無無無無亞基數(shù)目4142≥4催化亞基的大小（k）160~18540125125210~230或125~140對dNTPs的Km值(μM)2~51040.52~4內(nèi)在的進(jìn)行性中等低高低高在PCNA存在時的進(jìn)行性中等低高高高3′-外切酶活性××√√√5′-外切酶活性×××××對3′,5′-ddNTP的敏感性低高高低中等對阿拉伯糖CTP的敏感性高低低高高對四環(huán)雙萜的敏感性高低低高高生物功能細(xì)胞核DNA復(fù)制細(xì)胞核DNA修復(fù)線粒體DNA復(fù)制細(xì)胞核DNA復(fù)制核DNA復(fù)制和修復(fù)43整理ppt其他真核細(xì)胞DNA聚合酶

44整理ppt真核DNA聚合酶ζ和η在跨損傷合成中的作用

45整理ppt真核細(xì)胞DNA聚合酶δ由PCNA三個亞基構(gòu)成的滑動鉗結(jié)構(gòu)

46整理pptDNA解鏈酶DNA解鏈酶是一類催化DNA雙螺旋解鏈的酶。它幾乎參與和DNA有關(guān)的一切代謝過程，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)和重組。任何一種DNA解鏈酶都能夠結(jié)合DNA，這種結(jié)合與DNA序列無關(guān)，這是解鏈酶作用的前提。大多數(shù)解鏈酶優(yōu)先結(jié)合DNA的單鏈區(qū)域。解鏈酶除了能夠結(jié)合DNA以外，還能夠結(jié)合NTP，并同時具有內(nèi)在的依賴于DNA的NTP酶活性。所有的DNA解鏈酶都具有移位酶活性。其移位酶活性使得它沿著被結(jié)合的DNA鏈單向移動，以不斷地解開DNA雙鏈區(qū)域。47整理ppt大腸桿菌DnaB蛋白的解鏈酶活性

48整理ppt單鏈DNA結(jié)合蛋白〔SSB〕是一種專門與DNA單鏈區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)，為DNA復(fù)制、修復(fù)和重組的必需成分。SSB本身并沒有任何酶的活性，但通過與DNA單鏈區(qū)段的結(jié)合在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組中發(fā)揮以下幾個方面的作用：〔1〕暫時維持DNA的單鏈狀態(tài)，防止互補(bǔ)的單鏈在作為復(fù)制模板之前重新退火成雙螺旋；〔2〕防止DNA的單鏈區(qū)域自發(fā)形成鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，以消除它們對DNA聚合酶進(jìn)行性的影響；〔3〕包被DNA的單鏈區(qū)段，防止核酸酶對DNA單鏈區(qū)域的水解；〔4〕刺激某些酶的活性。49整理ppt大腸桿菌SSB與單鏈DNA結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)

50整理pptDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶是一類通過催化DNA鏈的斷裂、旋轉(zhuǎn)和重新連接而直接改變DNA拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)的酶。此類酶不僅可以解決在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和染色質(zhì)重塑過程中遇到的拓?fù)鋵W(xué)障礙，而且能夠細(xì)調(diào)細(xì)胞內(nèi)DNA的超螺旋程度，以促進(jìn)DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，同時防止DNA形成有害的過度超螺旋。按照DNA鏈的斷裂方式，拓?fù)洚悩?gòu)酶被分為I型和II型。I型在作用過程中，只能切開DNA的一條鏈，而II型均為寡聚體蛋白，在作用過程中同時交錯切開DNA的兩條鏈，并能在消耗ATP的同時將一個DNA雙螺旋從一個位置經(jīng)過另一個雙螺旋的裂口“主動運(yùn)輸〞到另外一個位置。II型拓?fù)洚悩?gòu)酶主要參與DNA復(fù)制，既可以在DNA分子中引入有利于復(fù)制的負(fù)超螺旋，又可以及時去除復(fù)制叉前進(jìn)中形成的正超螺旋，還能分開復(fù)制結(jié)束后纏繞在一起的兩個子代DNA分子，其催化的反響依賴于ATP。51整理pptDNA復(fù)制過程中形成的正超螺旋

52整理pptDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶催化的轉(zhuǎn)酯反響53整理pptII型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機(jī)理

54整理pptDNA引發(fā)酶是一種專門用來起動或引發(fā)DNA合成的酶。由于DNA聚合酶本身不能起動多聚物的合成，只能延伸已經(jīng)被起動的多聚物，因此，引發(fā)酶是DNA復(fù)制所必需的。因為DNA復(fù)制的半不連續(xù)性，故引發(fā)酶在前導(dǎo)鏈上只需引發(fā)一次，而在后隨鏈上那么需用引發(fā)屢次。55整理ppt切除引物的酶RNA引物只是用來起動DNA的復(fù)制，它最終并不存在于被復(fù)制的DNA分子之中，遲早要被除去，實際上，細(xì)胞內(nèi)有專門的酶負(fù)責(zé)切除RNA引物。原核細(xì)胞內(nèi)切除RNA的酶是DNA聚合酶I或核糖核酸酶H。真核細(xì)胞負(fù)責(zé)切除RNA引物的酶是RNaseHⅠ/FEN1或FEN1/Dna2。56整理pptDNA連接酶是一類催化一個雙螺旋DNA內(nèi)相鄰核苷酸3′-羥基和5′-磷酸甚至兩個雙螺旋DNA兩端的3′-羥基和5′-磷酸發(fā)生連接反響形成3′,5′-磷酸二酯鍵的酶。DNA連接酶在DNA復(fù)制過程中的作用是“縫合〞后隨鏈上相鄰的岡崎片段，使不連續(xù)合成的后隨鏈成為一條連續(xù)的鏈。DNA連接酶在催化連接反響時需消耗能量。根據(jù)能量供體的性質(zhì)，連接酶可以分為兩類：第一類使用NAD+，第二類使用ATP。細(xì)菌的DNA連接酶屬于第一類，真核細(xì)胞、古菌、病毒和噬菌體的連接酶屬于第二類。57整理pptDNA連接酶的作用機(jī)理

58整理ppt尿嘧啶-DNA糖苷酶尿嘧啶-DNA糖苷酶是一種專門用來切除出現(xiàn)在DNA鏈上非正常尿嘧啶堿基的水解酶。尿嘧啶出現(xiàn)在DNA鏈上有兩種原因：一是在DNA復(fù)制過程中，細(xì)胞中存在的dUTP代替dTTP直接進(jìn)入新合成的DNA鏈；二是DNA分子中的C發(fā)生自發(fā)脫氨基作用。59整理ppt端聚酶的結(jié)構(gòu)與功能端聚酶也稱為端粒酶，由蛋白質(zhì)和RNA兩種成分組成，其中蛋白質(zhì)具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，其三維結(jié)構(gòu)與其它逆轉(zhuǎn)錄酶有明顯的相似性，而RNA含有1.5拷貝的端粒DNA重復(fù)序列，這一局部序列作為逆轉(zhuǎn)錄酶的模板。不同來源的端聚酶在RNA長度上變化很大，但它們都形成特定的二級結(jié)構(gòu)，作為模板的那一局部序列處于單鏈狀態(tài)，以方便它與端粒區(qū)的重復(fù)序列結(jié)合，并有效地充當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄的模板。60整理ppt幾種真核生物的端粒重復(fù)序列物種名稱重復(fù)序列四膜蟲、草履蟲和纖毛蟲T2G4酵母(TG)1~3TG2~3擬南芥T3AG3人T2AG361整理ppt端聚酶的結(jié)構(gòu)模型

62整理ppt端聚酶的作用機(jī)理

63整理ppt端粒酶活性與細(xì)胞分裂能力的關(guān)系

64整理ppt以大腸桿菌為代表的“θ-復(fù)制〞系統(tǒng)DNA復(fù)制的起始——起始于OriC的識別，結(jié)束于引發(fā)體的形成DNA復(fù)制的延伸〔1〕復(fù)制體的形成〔2〕前導(dǎo)鏈合成〔3〕后隨鏈合成〔4〕前導(dǎo)鏈合成和后隨鏈合成之間的協(xié)調(diào)DNA復(fù)制的終止和子代DNA的別離65整理ppt參與大腸桿菌DNA復(fù)制的主要蛋白質(zhì)或酶的名稱和功能蛋白質(zhì)名稱功能DNA旋轉(zhuǎn)酶II型拓?fù)洚悩?gòu)酶，負(fù)責(zé)清除復(fù)制叉前進(jìn)中的拓?fù)鋵W(xué)障礙SSB單鏈結(jié)合蛋白DnaA蛋白復(fù)制起始因子，識別復(fù)制起始區(qū)OriCDnaB蛋白DNA解鏈酶DnaC蛋白招募DnaB蛋白到復(fù)制叉DnaG蛋白DNA引發(fā)酶，引物合成DnaT蛋白輔助DnaC蛋白的作用HU蛋白類似于真核細(xì)胞的組蛋白，結(jié)合DNA并使DNA彎曲PriA蛋白引發(fā)體的裝配PriB蛋白引發(fā)體的裝配PriC蛋白引發(fā)體的裝配DNA聚合酶IIIDNA鏈的延伸DNA聚合酶I切除引物，填補(bǔ)空隙DNA連接酶縫合相鄰的岡崎片段DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV分離子代DNATus復(fù)制終止66整理ppt大腸桿菌DNA復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)

67整理ppt大腸桿菌DNA復(fù)制過程中引發(fā)體的形成

68整理ppt大腸桿菌DNA復(fù)制過程中復(fù)制體的形成

69整理ppt大腸桿菌DNA復(fù)制的延伸

70整理ppt大腸桿菌DNA復(fù)制終止區(qū)的結(jié)構(gòu)

71整理ppt子代DNA的別離72整理ppt“滾環(huán)復(fù)制〞某些噬菌體〔如M13和ФX174〕DNA和一些小的質(zhì)?！踩缈莶輻U菌內(nèi)的pIM13質(zhì)?！吃谒拗骷?xì)胞內(nèi)通過滾環(huán)復(fù)制方式擴(kuò)增DNA。真核細(xì)胞的某些基因，如某些兩棲動物卵母細(xì)胞內(nèi)的rRNA基因和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的二氫葉酸復(fù)原酶基因，在特定的情況下通過滾環(huán)復(fù)制在較短的時間內(nèi)迅速增加目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。73整理ppt滾環(huán)復(fù)制

74整理pptD-環(huán)復(fù)制線粒體和葉綠體DNA通常以D-環(huán)的方式進(jìn)行復(fù)制。少數(shù)病毒〔如腺病毒〕也進(jìn)行D-環(huán)復(fù)制。催化線粒體DNA復(fù)制的酶是DNA聚合酶γ，兩條鏈的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成岡崎片段，因此都是連續(xù)合成。兩條子鏈的合成在時間上不同步。75整理pptD環(huán)復(fù)制

76整理ppt真核細(xì)胞的DNA復(fù)制真核細(xì)胞的DNA復(fù)制在很多方面與細(xì)菌極為相似，但也有幾點(diǎn)不同于細(xì)菌的地方：〔1〕需要解決核小體和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對DNA復(fù)制構(gòu)成的障礙；〔2〕復(fù)制叉移動的速度遠(yuǎn)低于細(xì)菌；〔3〕具有多個復(fù)制子，這可以彌補(bǔ)復(fù)制叉移動速度低對整個DNA復(fù)制速度的制約；〔4〕岡崎片段的長度小于細(xì)菌；〔5〕復(fù)制被限制在細(xì)胞周期的S期，并受到嚴(yán)格的調(diào)控；〔6〕在第一輪復(fù)制結(jié)束之前不能進(jìn)行第二輪復(fù)制，細(xì)菌在第一輪復(fù)制還沒結(jié)束的時候就可以進(jìn)行第二輪復(fù)制；〔7〕需要端聚酶解決染色體DNA末端復(fù)制問題〔8〕復(fù)制終止沒有特定的像大腸桿菌Ter序列的終止區(qū)。77整理ppt真核細(xì)胞DNA復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)模型

78整理pptSV40的DNA復(fù)制模型

79整理ppt線形DNA末端復(fù)制問題的解決使用端聚酶；將線形DNA暫時轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)形DNA；經(jīng)重組形成串聯(lián)體；滾環(huán)復(fù)制；使用蛋