氣相色譜法測定尿樣中有機(jī)磷農(nóng)藥代謝物

氣相色譜法測定尿樣中有機(jī)磷農(nóng)藥代謝物

有機(jī)磷農(nóng)藥（ops）是農(nóng)業(yè)和園藝中使用最廣泛的農(nóng)藥和殺菌劑。它是中國產(chǎn)量最高的農(nóng)藥品種，也是農(nóng)藥中毒和食品殘留的主要類型。根據(jù)OPs的化學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì),可以通過生物監(jiān)測來評價人體接觸毒物的程度及可能產(chǎn)生的潛在健康影響。由于大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥在進(jìn)入體內(nèi)后能迅速分解破壞,通常在接觸有機(jī)磷農(nóng)藥24～48h后在尿中排出代謝產(chǎn)物,代謝為6種二烷基磷酸酯類(diakylphosphrates,DAP)化合物的一種或數(shù)種。因而,測定尿中的有機(jī)磷農(nóng)藥代謝產(chǎn)物是一種評價有機(jī)磷農(nóng)藥接觸的敏感方法,它可特征性地揭示接觸劑量,反映暴露途徑和危害程度。色譜法結(jié)合質(zhì)譜(MS)聯(lián)用技術(shù)為解決低劑量有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝物的檢測提供了有效方法。已報道的有機(jī)磷農(nóng)藥代謝產(chǎn)物的分析方法多為檢測兩種或以上代謝產(chǎn)物,常采用提取凈化、分步衍生和火焰光度檢測器來分析。樣品的前處理和衍生化反應(yīng)是實驗成敗的關(guān)鍵,直接影響到方法的準(zhǔn)確度和靈敏度,因此研究和開發(fā)一種成本低、凈化效果好、回收率高的方法非常重要。本文在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,改進(jìn)優(yōu)化了樣品前處理方法,采用有機(jī)溶劑乙腈多次提取、凈化,改善了提取效果減少干擾,加入無水硫酸鈉進(jìn)一步脫水處理使衍生化反應(yīng)進(jìn)行,并對衍生化產(chǎn)物進(jìn)行了質(zhì)譜確證。樣品、質(zhì)譜和儀器儀器ShimadzuGC-14B氣相色譜儀,配火焰光度檢測器(P濾光片)和SrAdv色譜數(shù)據(jù)工作站,色譜柱:DB-17毛細(xì)管柱(30m×0.32mm×0.25μm)。TraceDSQ氣-質(zhì)聯(lián)用儀(美國Finningan公司)色譜柱:DB-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)。80-2B臺式離心機(jī),PierceReacti-ThermHeatingModule氮吹儀,XW-80A漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。試劑二烷基磷酸酯類標(biāo)準(zhǔn)樣品:磷酸二甲酯(簡稱DMP,98%,AcrosOrganics),磷酸二乙酯(磷酸平衡)(簡稱DEP,75%,AcrosOrganics),二乙基硫代磷酸酯(簡稱DETP,98%,Aldrich),二甲基二硫代磷酸酯(簡稱DMDTP,70%,上海農(nóng)藥研究所),二乙基二硫代磷酸酯甲鹽(簡稱DEDTP,97%,Aldrich),內(nèi)標(biāo)物二丁基磷酸酯(簡稱DBP,97%,Fluka)。各標(biāo)準(zhǔn)樣品用乙腈配制成濃度為4.0g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液(4℃保存,使用前稀釋成4.0mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液),衍生試劑五氟溴芐苯(簡稱PFBBr,99%,LancasterSynthesis),無水碳酸鉀(分析純,使用前在120℃烘2～3h),無水硫酸鈉(分析純),乙腈(HPLC級)。尿樣貯于-18℃冰箱,對照尿樣取自健康的男性兩歲幼兒。氣相色譜條件柱溫程序升溫:110℃(1min)→8℃/min→210℃(10min),進(jìn)樣口溫度:280℃,檢測器溫度:300℃;載氣:高純氮;進(jìn)樣量:1.0μL。采用保留時間定性,內(nèi)標(biāo)法定量計算。氣相-質(zhì)譜聯(lián)用條件載氣為氦氣(99.999%),流量1mL/min;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣體積1.0μL,進(jìn)樣口溫度250℃,溫度梯度:110℃(1min)→8℃/min→210℃(1min)→20℃/min→280℃(10min)。質(zhì)譜條件:負(fù)化學(xué)電離源,離子源溫度250℃,傳輸線溫度250℃,反應(yīng)氣甲烷,流量1mL/min,全掃描模式收集質(zhì)荷比,掃描質(zhì)量范圍50-400。樣品處理取尿樣1mL于10mL離心試管中,加入1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液50μL(含四丁基溴化銨60mg/mL),再加入內(nèi)標(biāo)工作液(DBP)150μL,加入乙腈提取液7mL,經(jīng)旋渦混合后,離心10min(≥2500r/min)。取上清液于另一10mL離心試管中,于70℃水浴中用高純氮氣緩慢吹至約0.2mL;第二次加入乙腈4mL,經(jīng)旋渦混合用氮氣流吹至約0.2mL。第三次加入脫水乙腈2mL,加入經(jīng)干燥的無水硫酸鈉約1g,旋渦混合后放置數(shù)分鐘,離心10min(≥2500r/min)。將上清液傾倒于2mL自動進(jìn)樣器小瓶,在氮吹儀上于室溫吹至0.1～0.2mL。最后加入五氟溴芐苯30μL,加入經(jīng)干燥的碳酸鉀約20mg,蓋緊蓋子后于50℃恒溫箱中衍生化反應(yīng)16h,反應(yīng)完成后加入100μL甲苯置于-18℃冷藏條件下,測定前取出。吸取1μL上清液冷針法進(jìn)樣測定。線性方程和檢測限、檢出限、相對回收率的計算色譜結(jié)果本試驗條件下,5種有機(jī)磷農(nóng)藥代謝產(chǎn)物DMP、DEP、DMDTP、DETP、DEDTP和內(nèi)標(biāo)DBP在12分鐘內(nèi)得到良好分離。DMP、DEP、DMDTP、DETP、DEDTP、DBP保留時間(min)分別為:5.49、6.61、8.49、8.79、9.35、10.6。圖1A是有機(jī)磷代謝物標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖,圖1B是某尿樣的色譜圖。工作曲線與線性范圍取對照尿樣1mL,加入不同量的DMP、DEP、DMDTP、DETP、DEDTP混合標(biāo)準(zhǔn)液配成濃度為0,40.0,200.0,400.0,800.0,1200.0μg/L的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述樣品處理方法和色譜工作條件測定,測量峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)代謝物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值和標(biāo)準(zhǔn)代謝物濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程。各代謝物的線性范圍為0～1200μg/L,線性方程Y=BX+A(其中Y為代謝物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值,X為代謝物的質(zhì)量濃度)結(jié)果見表1。檢測限(MDL)按照EPA規(guī)定方法測定計算方法的檢出限。取5份相同的尿樣,平行操作,各加入相當(dāng)于估測檢測限3～5倍量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照前述樣品處理和測定方法,求得5次測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差S,查表得到t(n-1,α=0.99)統(tǒng)計檢驗值,兩者的乘積即為檢測限MDL值。結(jié)果見表1。精密度分別取尿樣1mL,加入低、中、高3個混合標(biāo)準(zhǔn)代謝物濃度,每個濃度平行做3份,按照前述樣品處理方法和色譜工作條件測定。求得各代謝物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。精密度結(jié)果見表2。加標(biāo)相對回收率試驗方法步驟中有衍生化反應(yīng)時,均經(jīng)分析方法步驟后基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)品濃度與純?nèi)軇┲袠?biāo)準(zhǔn)品濃度的百分比稱為相對回收率。試驗采用這種方法計算加標(biāo)回收率。分別取尿樣和乙腈1mL,平行操作5份,按照前述樣品處理方法和色譜工作條件測定,計算相對回收率,結(jié)果見表2。(結(jié)果顯示DMDTP的相對回收率較高,可能由于DMDTP純度較低引起的誤差大,本文未把此結(jié)果計入。)衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜分析采用氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)全掃描方式對衍生化產(chǎn)物進(jìn)行了確證,得到各代謝物的質(zhì)譜圖,可以看出各代謝物的質(zhì)譜斷裂方式為失去一個質(zhì)子,得到M-1的分子離子峰,質(zhì)譜圖見圖2～6。衍生化反應(yīng)通式為:式中R1、R2為甲基或乙基,R1、R2可相同也可不同。二烷基(硫代)磷酸酯和五氟溴芐苯(PFBBr)發(fā)生衍生化反應(yīng),衍生化反應(yīng)主要分兩步進(jìn)行,先是衍生劑PFBBr的溴原子脫離,形成帶正電荷的基團(tuán),再與離子化的二烷基(硫代)磷酸酯結(jié)合生成衍生物。樣品測定按照前述方法對某些尿樣有機(jī)磷農(nóng)藥的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測,結(jié)果見表3。樣品的預(yù)處理尿樣提取方法的優(yōu)化與比較文獻(xiàn)采用乙腈作為提取劑,加入7mL乙腈2次提取凈化,在氮氣流下吹干得到完全干燥的剩余物,再加入乙腈溶解。試驗發(fā)現(xiàn),樣品提取物吹干后附著在器壁上,提取不完全,方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性不理想。本文對此進(jìn)行了優(yōu)化與改進(jìn),先在尿樣中加入1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液50μL(含四丁基溴化銨60mg/mL),再加入7mL乙腈提取液,在氮氣氣流下緩慢吹至約0.2mL,第二次加入4mL乙腈,重復(fù)操作,最后的提取物再加干燥后的無水硫酸鈉進(jìn)一步脫水,使樣品提取物的水分減至最少。提取完成后加入干燥的碳酸鉀和五氟溴芐苯進(jìn)行衍生化反應(yīng)。改進(jìn)后減少了乙腈的用量,方法簡便。試驗結(jié)果表明方法