產(chǎn)-氨基丁酸植物乳桿菌ndc75017培養(yǎng)基優(yōu)化研究

產(chǎn)-氨基丁酸植物乳桿菌ndc75017培養(yǎng)基優(yōu)化研究

0菌株的制備和發(fā)酵隨著人們生活水平的提高，山羊食品的消耗量逐年增加。在食品中添加抗生素的主要方法是直接添加抗生素或用無菌制劑添加。益生菌制劑制備的關鍵技術對乳酸菌進行高密度培養(yǎng)。限制乳酸菌高密度培養(yǎng)的主要因素是底物消耗和酸的積累。國外一些研究者對限制乳酸菌高密度培養(yǎng)的底物、緩沖鹽、生長因子等做了大量研究。植物乳桿菌屬于乳酸桿菌屬,有很強的發(fā)酵碳水化合物的能力,耐膽鹽,免疫調節(jié),拮抗致病菌和抗突變等益生性質。本研究采用的植物乳桿菌NDC75017分離自內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中,具有許多益生功能。實驗對影響菌體生長的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件進行了研究,提高了菌體活菌數(shù)和生物量,為乳酸菌發(fā)酵劑的制備奠定了基礎。1實驗1.1培養(yǎng)基的制備植物乳桿菌NDC75017分離自內蒙古通遼地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中。MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母粉5g,胰蛋白胨10g,Tween-801mL,葡萄糖20g,磷酸氫二鉀2g,檸檬酸氫二銨2g,乙酸鈉5g,硫酸鎂0.5g,硫酸錳0.25g,蒸餾水定容至1000mL,調pH值至5.8。121℃滅菌15min,用于菌體的活化。MRS固體培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂,121℃滅菌15min,用于菌體計數(shù)。增殖培養(yǎng)基:按照實驗設計配方配制,121℃滅菌15min,用于菌體增殖培養(yǎng)。1.2u3000密封、蒸發(fā)與紫外分光光度BCN1360型生物潔凈工作臺,GL-21M高速冷凍離心機,滅菌鍋,DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱,精密天平與精密pH計,紫外分光光度計DU800。1.3方法1.3.1蘑菇的激活從-80℃取出菌株復蘇純化,按2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中,30℃活化培養(yǎng)兩代。1.3.2碳源、氮源、緩沖鹽、生長因子和培訓條件的篩選將活化好的種子液按2%的比例分別接種至不同種類的碳源、氮源、緩沖鹽及不同的培養(yǎng)條件下(不同溫度、pH值)的培養(yǎng)基中。1.3.3活菌計數(shù)每隔2h取樣,將發(fā)酵液進行10倍梯度稀釋,取10-7~10-9三個梯度進行平板涂布,30℃培養(yǎng)48h計數(shù)。1.3.4光光度計測定每隔2h取樣,發(fā)酵液的菌體密度用紫外分光光度計在波長600nm下測定。如果菌液過濃則稀釋一定倍數(shù)使光密度在0.2~1.2之間,菌體密度值為測定值乘以稀釋倍數(shù)。1.3.5r/min條件下離心10mim每隔2h取樣,發(fā)酵液在4000r/min條件下離心10mim。將得到的菌泥用質量分數(shù)為0.85%的生理鹽水洗滌三遍,70℃烘箱烘干至恒重。1.3.6ph測量每隔2h取樣,用精密pH計測定不同發(fā)酵時間點的pH值。1.3.7葡萄糖質量濃度的測定采用葡萄糖測定試劑盒(葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶法,上海榮盛生物藥業(yè)),每隔2h取樣測定菌體在生長過程中葡萄糖質量濃度的變化。1.4實驗設計1.4.1單因素實驗設計根據(jù)單因素實驗篩選得到的對植物乳桿菌NDC75017生長有顯著影響的因素:葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、檸檬酸氫二銨、乙酸銨、乙酸鈉、Tween80、硫酸鎂和硫酸錳10個因素進行實驗設計。每個實驗因素取2個水平,高水平(+1)為低水平(-1)的1.5倍,以植物乳桿菌的菌體濃度為響應值。1.4.2最陡峭邊坡的實驗設計根據(jù)Plackett-Burman實驗設計篩選得到的影響菌體濃度的顯著影響因素確定最陡爬坡試驗的方向和梯度,確定試驗因素的中心點。1.4.3gn-oppert響應面設計根據(jù)1.4.1和1.4.2確定的試驗因素和中心點,采用Design-Expert軟件進行3因素3水平的響應面設計,將得到的試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合,得到一個響應變量與自變量之間的模型。根據(jù)建立的模型計算得到植物乳桿菌NDC75017最佳增殖培養(yǎng)基配方。1.4.4普通mrs培養(yǎng)基和響應面培養(yǎng)基的設計將活化好的種子液按2%的比例分別接種至普通MRS培養(yǎng)基和1.4.3響應面設計的增值培養(yǎng)基中,30℃靜置培養(yǎng)。每隔2h取樣測定發(fā)酵液的活菌數(shù)及干重。1.5數(shù)據(jù)分析與研究實驗過程每組實驗做3個平行。采用DesignExpert17.0設計軟件進行響應面設計分析;采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行顯著性差異分析;數(shù)據(jù)計算、繪圖采用MicrosoftExcel2003軟件。2結果與分析2.1不同ph值、葡糖的濃度對酵母粉質量濃度的影響植物乳桿菌NDC75017的生長曲線如圖1所示。由圖1可以看出,菌體生長至12h時達到穩(wěn)定期,此時活菌數(shù)最高達到6.48×1010mL-1;菌體整個生長過程中,發(fā)酵液中的pH值從5.8下降到3.4,葡糖的質量濃度從16.6g/L下降到1.2g/L。另外,從圖中可以明顯看出,當菌體生長到18h時活菌數(shù)迅速下降,可能原因是由于營養(yǎng)物質如碳源的消耗和pH值的下降(主要是菌體代謝葡萄糖產(chǎn)生乳酸造成的)造成菌體活力下降,并出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象。2.2復合氮源、緩沖溶液和培養(yǎng)基由圖2~圖5可以看出,對植物乳桿菌NDC75017有明顯促進作用的碳源為葡萄糖,氮源為酵母粉、牛肉膏和胰蛋白胨,緩沖鹽為檸檬酸氫二銨和乙酸銨,生長因子為硫酸錳、硫酸鎂和Tween80。有研究者研究證明復合氮源比單一氮源更有利于乳酸菌的生長。本實驗選用酵母粉、牛肉膏和胰蛋白胨為植物乳桿菌NDC75017生長的復合氮源。2.3培養(yǎng)基中各微量元素的含量對發(fā)酵條件的影響實驗設計篩選因素編碼及水平如表1和表2所示。由表1和表2可以看出,每個實驗設計方案下植物乳桿菌NDC75017活菌數(shù)的變化。表3是根據(jù)表2中的實驗結果對實驗過程選取的每個實驗因素效應大小進行分析的結果。由表3可以看出,X1(葡萄糖)、X6(乙酸銨)2個因素的效應為負,表明因素X1(葡萄糖)、X6(乙酸銨)對菌體濃度的影響為負效應,即隨著培養(yǎng)基中葡萄糖、乙酸銨含量的增加,活菌數(shù)呈下降趨勢;其余因素的效應為正,均為正效應。其中葡萄糖、檸檬酸氫二銨、乙酸銨和硫酸錳的P值均小于0.05,表明這三個因素對活菌數(shù)的影響顯著。而檸檬酸氫二銨、乙酸銨在菌體生長過程中均起到緩沖鹽的作用,為了后續(xù)實驗設計方便,這里只選取檸檬酸氫二銨作為培養(yǎng)基中的緩沖鹽。故采用葡萄糖、檸檬酸氫二銨和硫酸錳這3個因素為主要研究對象做后續(xù)研究,利用最陡爬坡實驗確定三個因素的最佳濃度范圍。2.4響應面實驗結果根據(jù)2.3實驗結果篩選得到的顯著影響因素的效應大小確定最陡爬坡試驗的方向和梯度(見表4)并進行實驗,根據(jù)實驗結果確定響應面實驗設計因素的中心點。由表4可以看出,隨著葡萄糖質量濃度降低,檸檬酸氫二銨和硫酸錳濃度的升高,活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢,活菌最高的響應值區(qū)域在第四組實驗。故響應面設計因素的中心點為葡萄糖15g/L,檸檬酸氫二銨3.5g/L,硫酸錳0.4g/L。2.5回歸方程和模型建立分析根據(jù)2.3和2.4實驗篩選得到的對菌體生長有顯著影響的因素葡萄糖、檸檬酸氫二銨、硫酸錳和由最陡爬坡實驗確定的試驗因素中心點,采用DesignExpert17.0軟件進行3因素3水平的響應面設計。表5是以葡萄糖、檸檬酸氫二銨、硫酸錳3個因素為自變量,植物乳桿菌NDC75017活菌數(shù)為響應值,設計3因素3水平Box-Behnken實驗方案。表6是根據(jù)表5設計方案得到的實驗結果。響應面設計實驗結果如圖6所示。根據(jù)表6的實驗結果,通過Design-Expert17.0軟件處理確定回歸方程:Y=6.65+0.39X1+0.013X2+0.19X3+0.11X1X2-0.100X1X3+0.0073X2X3-0.77X12-0.43X22-0.44X32,式中:Y為植物乳桿菌NDC75017菌體濃度的預測響應值;X1為葡萄糖的編碼值;X2為檸檬酸氫二銨的編碼值;X3為硫酸錳的編碼值?；貧w方程方差分析如表7所示。由表7可以看出,經(jīng)Design-Expert17.0軟件分析,所建立的模型Prob>F值為0.0012小于0.01表明建立的模型影響極顯著;模型失擬項Prob>F為0.0632,大于0.05,即失擬項不顯著,說明本試驗建立的模型在整個回歸區(qū)域的擬合度較好,接近真實的響應曲面情況,模型建立合理;CV(變異系數(shù))表示模型的精確度,本研究模型中CV=3.83%,較低,說明模型精確度高,結果可信。模型的決定系數(shù)R2=94.51%,矯正系數(shù)R2Adj=87.46%,表明預測值與實際值之間具有高度相關性,能解釋87.46%的響應值變化,故可以利用此模型代替真實試驗點對植物乳桿菌NDC75017的菌體濃度進行預測。從響應面分析可知,回歸模型存在最大值。根據(jù)Design-Expert17.0軟件得到的回歸方程可計算得到Y的最大估計值為6.72×1010mL-1,此時葡萄糖16.31g/L、檸檬酸氫二銨3.52g/L,硫酸錳0.41g/L。2.5響應面預測的最大活菌數(shù)的測定圖7為優(yōu)化前后細胞生物量的變化,經(jīng)優(yōu)化后細胞干重由原來的3.31g/L提高到3.93g/L,細胞干重提高了原來的1.2倍。圖8為優(yōu)化前后細胞活菌數(shù)的變化,經(jīng)優(yōu)化后,最大活菌數(shù)由原來的3.15×1010mL-1提高到6.48×1010mL-1,活菌數(shù)提高了2.1倍。且活菌數(shù)與響應面預測的最大活菌數(shù)6.72×1010mL-1接近。說明回歸方程能夠真實的反映篩選因素對植物乳桿菌NDC75017生長的影響,對于培養(yǎng)基的優(yōu)化研究具有指導意義。3最大活菌數(shù)和細胞干重實驗通過Plackett-Burman法、最陡爬坡試驗和Box-Behnken設計對植物乳桿菌培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化。確定了植物乳桿菌增值的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖16.31g/L,酵母粉7.5g/L,胰蛋白胨15g/L,牛肉膏7.5g/L,檸檬酸氫二銨3.52