羅非魚腹腔注射塔瑪亞歷山大藻對鰓及肝組織na

羅非魚腹腔注射塔瑪亞歷山大藻對鰓及肝組織na

水生養(yǎng)殖在許多沿海國家中通常發(fā)揮著重要作用。近幾十年來,作為對捕撈業(yè)的重要補充,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展十分迅速。但有害赤潮的發(fā)生使養(yǎng)殖業(yè)受到嚴重的威脅。其中麻痹性貝毒是一個重要因素。在亞太地區(qū),從1934年到1994年間發(fā)生的赤潮對養(yǎng)殖業(yè)的危害事件中,麻痹性貝毒(PSP)事件占了41.7%,導致這些事件的主要是Pyrodiniumbahamense-pressum,Alexandriumtamarense,Gymnodiniumcatenatum等甲藻。其中又以塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarinse)分布最廣。麻痹性貝毒是一類四氫嘌呤的衍生物?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的毒素有20多種,根據(jù)R4基團的不同可以分為4類,分別是氨基甲酸酯類毒素(Carbamatetoxin),包括石房蛤毒素(STX),新石房蛤毒素(neoSTX),膝溝藻毒素1-4(GTXI-4);N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfcarbamoy1toxins),包括B1-2,C1-4;脫氨甲酰基類毒素(decarbamoyltoxin),包括dcSTX,dcneoSTX,dcGTXI-4;脫氧脫氨甲?；惗舅?deoxydecarbamoy1toxins),包括doSTX,doGTX2,3,最近又在一種蟹Zosimusaeneus中檢出了石房蛤毒素和新石房蛤毒素的N-羥基衍生物(N-hydroxycarbamoylderivatives)hySTX和hyneoSTX,可能是一類新的麻痹性貝毒毒素。由于Na+-K+-ATPase在低等、高等生物體內普遍存在,具有廣泛的生態(tài)意義,在機體中起到至關重要的作用,并且是多種毒物攻擊的靶點。因此在本次實驗中作者采用檢測染毒生物體興奮性和分泌性組織中Na+-K+-ATPase活力的方法,對塔瑪亞歷山大藻對該酶的影響及機理進行分析1材料和方法1.1光照、暗比塔瑪亞歷山大藻由本實驗室培養(yǎng),培養(yǎng)條件為非無菌培養(yǎng),f/2培養(yǎng)基;溫度20℃±1℃;光照3000lx;光暗比為12h∶12h。取培養(yǎng)8d的藻液離心10min(4000r/min)棄去上清液,加入等量0.05mol/L醋酸與藻細胞沉淀混勻后,凍融多次,再以15000r/min離心20min去除藻殼,得到毒素粗提液。1.2設備和試劑1.2.1儀器(1)DU520型紫外分光光度計;(2)高速冷凍離心機;(3)玻璃勻漿器;(4)電子天平;(5)解剖器。1.2.2氯醋酸鈉l(1)甘露醇(0.35mol/L);(2)牛血清蛋白(1mg/L);(3)蔗糖(0.25mol/L);(4)EDTA(0.001mol/L);(5)Tris-HCl緩沖液(pH=7.2,pH=7.5);(6)ATP(3mmol/L);(7)NaCl(110mmol/L);(8)MgCl2(3mmol/L);(9)KCl(10mmol/L);(10)Na2HPO4(0.001mol/L);(11)三氯醋酸TCA(20%);(12)硫酸亞鐵-鉬酸銨[5g硫酸亞鐵+10%硫酸鉬酸銨10mL(硫酸鉬酸銨用10mol/L的溶液配制)+水稀釋成70mL];(13)考馬斯亮藍(100mg考馬斯亮藍溶于50mL95%乙醇,加入100mL磷酸定容于1L容量瓶,過濾,4℃保存)。1.3實驗方法1.3.1分組及注射不同濃度的毒素羅非魚體質量50g/尾左右,采自集美大學淡水養(yǎng)殖場。在染毒前于曝氣自來水中暫養(yǎng)48h以上,挑選健壯、活躍的個體隨機分配到各個實驗組中,每一濃度梯度組選取4尾羅非魚。實驗分為4個濃度梯度組和一個對照組,對照組每尾魚注射0.4mL0.05mol/L的醋酸,染毒組分別注射0.4mL不同濃度的毒素粗提液。濃度設置為50%,33.3%,25%,16.7%組,以毒素粗提液為100%濃度,其余百分比為毒素粗提液以蒸餾水稀釋后的濃度。注射后暫養(yǎng)12h。解剖取其鰓及肝臟并測定其中Na+-K+-ATPase活力。1.3.2標準曲線的繪制(1)分別在兩組試管中,各加入0.5g/L牛血清蛋白(50,100,150,200μL)以0.15mmol/LNaCl補足至500μL,同時以兩管500μL的0.15mmol/LNaCl作空白對照。(2)每管加入5mL考馬期亮藍染料溶液,振蕩混勻,室溫放置2min后進行比色測定(波長595nm),以消光值為縱坐標,蛋白質含量為橫坐標,繪制標準曲線。(3)取100μL的樣品加入1mL考馬期亮藍染料,振蕩混勻,室溫放置2min后,于660nm處測吸光度A,在標準曲線上查得相應蛋白質濃度。1.3.3硫酸亞鐵-鰲酸銨氧合反應活性劑的合成(1)制作磷標準曲線:分別在兩組試管中各加入0.001mol/LNa2HPO4(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL),加雙蒸水使各管體積均為2.9mL,依次加入三氯醋酸0.1mL,硫酸亞鐵-鉬酸銨2.0mL,2min后,于波長660nm處測A值,以消光值為縱坐標,磷的含量為橫坐標,繪制標準曲線。(2)樣品Na+-K+-ATPase活力的測定:取0.9mL樣品加入1.8mL酶反應液,37℃保溫15min,加入0.1mL20%三氯醋酸終止反應,加入1.7mL硫酸亞鐵-鉬酸銨試液,2min后,于波長660nm處測光密度。在標準曲線上查得相應磷濃度。(3)Na+-K+-ATPase比活的計算:酶活力以每小時每毫克蛋白水解ATP釋放出的無機磷微摩爾數(shù)[μmol/(mg·h)]表示。2不同濃度的毒素對肝臟的pahs活性的影響根據(jù)小白鼠法測得本實驗塔瑪亞歷山大藻毒素粗提液原液的毒性為6.44鼠單位/mL,由此算出每尾魚注射液相應的毒性大小并列于各濃度下。從表1可見,在注射毒素濃度為16.7%的情況下,肝臟的Na+-K+-ATPase比活性最高,平均值達1.914。當毒素的濃度繼續(xù)增加時,活性反而降低。而鰓中Na+-K+-ATPase的比活也有類似現(xiàn)象,見表1及圖1。經(jīng)統(tǒng)計分析,染毒組個體肝臟Na+-K+-AT-Pase比活與對照組差異顯著(P<0.05),而鰓的比活差異不顯著(P>0.05)。3對海蘭非魚的毒性實驗羅非魚經(jīng)注射16.7%毒素粗提液,其肝臟、鰓組織Na+-K+-ATPase活性高于對照組。而注射25%～50%濃度則酶活性均低于對照組。這說明塔瑪亞歷山大藻毒素粗提液可造成實驗羅非魚鰓、肝臟等組織Na+-K+-ATPase活性改變。而且,在較低的濃度下往往是增加酶活性,較高濃度則能抑制酶活性。我們認為這是因為毒素進入動物體與鈉離子通道結合,阻斷鈉離子內流,而生物的應激反應促使酶超常活動以抵消危害,因此使得低濃度組魚組織Na+-K+-ATPase的活力增加。這種生物在不良環(huán)境下的應激反應在不少研究中已被證實,如某些藻類在低濃度石油影響下會增加光合作用強度和分裂速度,但隨著石油濃度的加大,二者均被抑制而降低;低劑量的DDT引起蟹的神經(jīng)興奮,激素分泌增多,因而促進其蛻皮和附肢的再生。但隨著注射毒素濃度的增加,塔瑪亞歷山大藻的毒性使得動物Na+-K+-ATPase受到抑制,活性越來越低,動物的生理機能最終受到破壞。在本實驗中各組羅非魚鰓中Na+-K+-AT-Pase的比活差異不顯著,這可能因為實驗采取腹腔注射毒素的方法,毒素未經(jīng)過鰓而直接侵入肝臟組織中。也有可能因為麻痹性貝毒在魚體內的不同組織中含量各有差異,通常在消化器官中的含量最高,而其他組織中的含量相對較低,因此Na+-K+-AT-Pase所受影響可能也不同。Na+-K+-ATPase是一組在細胞內離子轉運和能量代謝過程中起重要作用的酶系統(tǒng)。它從水解ATP分子中獲得能量,逆電化學梯度轉運Na+和K+,也稱鈉泵。Na+-K+-ATPase廣泛分布于各類細胞質膜上,其活性在不同的組織內差異很大,在興奮性和分泌性組織中酶活性很高。麻痹性貝毒的毒理機制是在分子層級上,阻斷鈉離子內流,其對鈉離子通道具有特殊親和性。當毒素與鈉離子通道結合后,將會使神經(jīng)傳導發(fā)生困難。使細胞不能提供正?；顒铀枰哪芰?嚴重情況下,可導致生物死亡。目前國內外在塔瑪亞歷山大藻對海洋動物的影響方面進行了較多研究,而本文就毒素引起生物生化參數(shù)變化的研究則將有助于闡明其作用的分子機制,并且已有的研究表明毒物對Na+-K+-ATPase抑制的濃度、時間具有依賴性。本實驗證明塔瑪亞歷山大藻對養(yǎng)殖動物重要的N