羅非魚腹腔注射塔瑪亞歷山大藻對(duì)鰓及肝組織na

羅非魚腹腔注射塔瑪亞歷山大藻對(duì)鰓及肝組織na

水生養(yǎng)殖在許多沿海國家中通常發(fā)揮著重要作用。近幾十年來,作為對(duì)捕撈業(yè)的重要補(bǔ)充,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展十分迅速。但有害赤潮的發(fā)生使養(yǎng)殖業(yè)受到嚴(yán)重的威脅。其中麻痹性貝毒是一個(gè)重要因素。在亞太地區(qū),從1934年到1994年間發(fā)生的赤潮對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害事件中,麻痹性貝毒(PSP)事件占了41.7%,導(dǎo)致這些事件的主要是Pyrodiniumbahamense-pressum,Alexandriumtamarense,Gymnodiniumcatenatum等甲藻。其中又以塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarinse)分布最廣。麻痹性貝毒是一類四氫嘌呤的衍生物?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的毒素有20多種,根據(jù)R4基團(tuán)的不同可以分為4類,分別是氨基甲酸酯類毒素(Carbamatetoxin),包括石房蛤毒素(STX),新石房蛤毒素(neoSTX),膝溝藻毒素1-4(GTXI-4);N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfcarbamoy1toxins),包括B1-2,C1-4;脫氨甲?；惗舅?decarbamoyltoxin),包括dcSTX,dcneoSTX,dcGTXI-4;脫氧脫氨甲?；惗舅?deoxydecarbamoy1toxins),包括doSTX,doGTX2,3,最近又在一種蟹Zosimusaeneus中檢出了石房蛤毒素和新石房蛤毒素的N-羥基衍生物(N-hydroxycarbamoylderivatives)hySTX和hyneoSTX,可能是一類新的麻痹性貝毒毒素。由于Na+-K+-ATPase在低等、高等生物體內(nèi)普遍存在,具有廣泛的生態(tài)意義,在機(jī)體中起到至關(guān)重要的作用,并且是多種毒物攻擊的靶點(diǎn)。因此在本次實(shí)驗(yàn)中作者采用檢測(cè)染毒生物體興奮性和分泌性組織中Na+-K+-ATPase活力的方法,對(duì)塔瑪亞歷山大藻對(duì)該酶的影響及機(jī)理進(jìn)行分析1材料和方法1.1光照、暗比塔瑪亞歷山大藻由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),培養(yǎng)條件為非無菌培養(yǎng),f/2培養(yǎng)基;溫度20℃±1℃;光照3000lx;光暗比為12h∶12h。取培養(yǎng)8d的藻液離心10min(4000r/min)棄去上清液,加入等量0.05mol/L醋酸與藻細(xì)胞沉淀混勻后,凍融多次,再以15000r/min離心20min去除藻殼,得到毒素粗提液。1.2設(shè)備和試劑1.2.1儀器(1)DU520型紫外分光光度計(jì);(2)高速冷凍離心機(jī);(3)玻璃勻漿器;(4)電子天平;(5)解剖器。1.2.2氯醋酸鈉l(1)甘露醇(0.35mol/L);(2)牛血清蛋白(1mg/L);(3)蔗糖(0.25mol/L);(4)EDTA(0.001mol/L);(5)Tris-HCl緩沖液(pH=7.2,pH=7.5);(6)ATP(3mmol/L);(7)NaCl(110mmol/L);(8)MgCl2(3mmol/L);(9)KCl(10mmol/L);(10)Na2HPO4(0.001mol/L);(11)三氯醋酸TCA(20%);(12)硫酸亞鐵-鉬酸銨[5g硫酸亞鐵+10%硫酸鉬酸銨10mL(硫酸鉬酸銨用10mol/L的溶液配制)+水稀釋成70mL];(13)考馬斯亮藍(lán)(100mg考馬斯亮藍(lán)溶于50mL95%乙醇,加入100mL磷酸定容于1L容量瓶,過濾,4℃保存)。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1分組及注射不同濃度的毒素羅非魚體質(zhì)量50g/尾左右,采自集美大學(xué)淡水養(yǎng)殖場(chǎng)。在染毒前于曝氣自來水中暫養(yǎng)48h以上,挑選健壯、活躍的個(gè)體隨機(jī)分配到各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中,每一濃度梯度組選取4尾羅非魚。實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)濃度梯度組和一個(gè)對(duì)照組,對(duì)照組每尾魚注射0.4mL0.05mol/L的醋酸,染毒組分別注射0.4mL不同濃度的毒素粗提液。濃度設(shè)置為50%,33.3%,25%,16.7%組,以毒素粗提液為100%濃度,其余百分比為毒素粗提液以蒸餾水稀釋后的濃度。注射后暫養(yǎng)12h。解剖取其鰓及肝臟并測(cè)定其中Na+-K+-ATPase活力。1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1)分別在兩組試管中,各加入0.5g/L牛血清蛋白(50,100,150,200μL)以0.15mmol/LNaCl補(bǔ)足至500μL,同時(shí)以兩管500μL的0.15mmol/LNaCl作空白對(duì)照。(2)每管加入5mL考馬期亮藍(lán)染料溶液,振蕩混勻,室溫放置2min后進(jìn)行比色測(cè)定(波長(zhǎng)595nm),以消光值為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)取100μL的樣品加入1mL考馬期亮藍(lán)染料,振蕩混勻,室溫放置2min后,于660nm處測(cè)吸光度A,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。1.3.3硫酸亞鐵-鰲酸銨氧合反應(yīng)活性劑的合成(1)制作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別在兩組試管中各加入0.001mol/LNa2HPO4(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL),加雙蒸水使各管體積均為2.9mL,依次加入三氯醋酸0.1mL,硫酸亞鐵-鉬酸銨2.0mL,2min后,于波長(zhǎng)660nm處測(cè)A值,以消光值為縱坐標(biāo),磷的含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)樣品Na+-K+-ATPase活力的測(cè)定:取0.9mL樣品加入1.8mL酶反應(yīng)液,37℃保溫15min,加入0.1mL20%三氯醋酸終止反應(yīng),加入1.7mL硫酸亞鐵-鉬酸銨試液,2min后,于波長(zhǎng)660nm處測(cè)光密度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)磷濃度。(3)Na+-K+-ATPase比活的計(jì)算:酶活力以每小時(shí)每毫克蛋白水解ATP釋放出的無機(jī)磷微摩爾數(shù)[μmol/(mg·h)]表示。2不同濃度的毒素對(duì)肝臟的pahs活性的影響根據(jù)小白鼠法測(cè)得本實(shí)驗(yàn)塔瑪亞歷山大藻毒素粗提液原液的毒性為6.44鼠單位/mL,由此算出每尾魚注射液相應(yīng)的毒性大小并列于各濃度下。從表1可見,在注射毒素濃度為16.7%的情況下,肝臟的Na+-K+-ATPase比活性最高,平均值達(dá)1.914。當(dāng)毒素的濃度繼續(xù)增加時(shí),活性反而降低。而鰓中Na+-K+-ATPase的比活也有類似現(xiàn)象,見表1及圖1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,染毒組個(gè)體肝臟Na+-K+-AT-Pase比活與對(duì)照組差異顯著(P<0.05),而鰓的比活差異不顯著(P>0.05)。3對(duì)海蘭非魚的毒性實(shí)驗(yàn)羅非魚經(jīng)注射16.7%毒素粗提液,其肝臟、鰓組織Na+-K+-ATPase活性高于對(duì)照組。而注射25%～50%濃度則酶活性均低于對(duì)照組。這說明塔瑪亞歷山大藻毒素粗提液可造成實(shí)驗(yàn)羅非魚鰓、肝臟等組織Na+-K+-ATPase活性改變。而且,在較低的濃度下往往是增加酶活性,較高濃度則能抑制酶活性。我們認(rèn)為這是因?yàn)槎舅剡M(jìn)入動(dòng)物體與鈉離子通道結(jié)合,阻斷鈉離子內(nèi)流,而生物的應(yīng)激反應(yīng)促使酶超常活動(dòng)以抵消危害,因此使得低濃度組魚組織Na+-K+-ATPase的活力增加。這種生物在不良環(huán)境下的應(yīng)激反應(yīng)在不少研究中已被證實(shí),如某些藻類在低濃度石油影響下會(huì)增加光合作用強(qiáng)度和分裂速度,但隨著石油濃度的加大,二者均被抑制而降低;低劑量的DDT引起蟹的神經(jīng)興奮,激素分泌增多,因而促進(jìn)其蛻皮和附肢的再生。但隨著注射毒素濃度的增加,塔瑪亞歷山大藻的毒性使得動(dòng)物Na+-K+-ATPase受到抑制,活性越來越低,動(dòng)物的生理機(jī)能最終受到破壞。在本實(shí)驗(yàn)中各組羅非魚鰓中Na+-K+-AT-Pase的比活差異不顯著,這可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)采取腹腔注射毒素的方法,毒素未經(jīng)過鰓而直接侵入肝臟組織中。也有可能因?yàn)槁楸孕载惗驹隰~體內(nèi)的不同組織中含量各有差異,通常在消化器官中的含量最高,而其他組織中的含量相對(duì)較低,因此Na+-K+-AT-Pase所受影響可能也不同。Na+-K+-ATPase是一組在細(xì)胞內(nèi)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝過程中起重要作用的酶系統(tǒng)。它從水解ATP分子中獲得能量,逆電化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運(yùn)Na+和K+,也稱鈉泵。Na+-K+-ATPase廣泛分布于各類細(xì)胞質(zhì)膜上,其活性在不同的組織內(nèi)差異很大,在興奮性和分泌性組織中酶活性很高。麻痹性貝毒的毒理機(jī)制是在分子層級(jí)上,阻斷鈉離子內(nèi)流,其對(duì)鈉離子通道具有特殊親和性。當(dāng)毒素與鈉離子通道結(jié)合后,將會(huì)使神經(jīng)傳導(dǎo)發(fā)生困難。使細(xì)胞不能提供正?；顒?dòng)所需要的能量,嚴(yán)重情況下,可導(dǎo)致生物死亡。目前國內(nèi)外在塔瑪亞歷山大藻對(duì)海洋動(dòng)物的影響方面進(jìn)行了較多研究,而本文就毒素引起生物生化參數(shù)變化的研究則將有助于闡明其作用的分子機(jī)制,并且已有的研究表明毒物對(duì)Na+-K+-ATPase抑制的濃度、時(shí)間具有依賴性。本實(shí)驗(yàn)證明塔瑪亞歷山大藻對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物重要的N