lc-esi-ms法測定大鼠膽汁、尿液和糞便中苯環(huán)喹溴銨的濃度

lc-esi-ms法測定大鼠膽汁、尿液和糞便中苯環(huán)喹溴銨的濃度

苯環(huán)溴化銨的化學(xué)名為3-{（2-環(huán)戊二-2-硝基二-苯基）二氧基。-1-甲基環(huán)磺酰胺-1-硝基環(huán)磺酰胺-2-環(huán)磺酰胺。辛烷[3-{（2-cyclopent-2-hydrocy-2phenyl）、環(huán)磷酰胺-1-azabicyclo[2-2-a]。一般稱為苯環(huán)溴化銨，以下簡稱bcqb（圖1a）。它是一種新的抗膽堿能化合物,藥理作用基本與異丙基阿托品一致,但對(duì)中樞膽堿能受體無作用,因此不會(huì)造成心動(dòng)過速或尿潴留等不良反應(yīng),是一個(gè)理想的抗鼻炎候選藥。與異丙阿托品相比,適應(yīng)人群應(yīng)該更廣,臨床上擬用于治療常年性過敏性鼻炎、常年性非過敏性鼻炎和各種急性鼻炎(如感冒引起的鼻腔粘膜分泌過度癥狀等)。BCQB已經(jīng)申請(qǐng)了中國專利和國際專利。本實(shí)驗(yàn)建立了LC-ESI-MS法測定大鼠膽汁、尿液和糞便中BCQB的濃度,首次報(bào)告了其不同排泄途徑的研究結(jié)果,為該藥在大鼠體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化過程和臨床用藥提供參考。1材料和方法1.1-乙基-溴化-1-氮雜雙環(huán)BCQB對(duì)照品由北京世橋生物制藥有限公司提供,批號(hào):031120,純度為99.5%。內(nèi)標(biāo):1-乙基-苯環(huán)喹溴銨,化學(xué)名:3-{(2-環(huán)戊基-2-羥基-2-苯基)乙氧基}-1-乙基-溴化-1-氮雜雙環(huán){2,2,2}辛烷)(圖1B),由北京世橋生物制藥有限公司提供,批號(hào):041205,純度為98.0%;苯扎氯銨(吉爾滅,輔料),由北京世橋生物制藥有限公司提供;3mL規(guī)格的C18固相萃取小柱(SupelcleanTMLC-18SPETube,SUPELCO,Bellefonte,PA,USA);實(shí)驗(yàn)用水為去離子水;甲醇(色譜純,MerckCompany,DarmstadtGermany);其它試劑均為市售分析純。1.2儀器、色譜傳播1100LC-MSSL聯(lián)用儀,含:雙高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、四極桿質(zhì)譜檢測器。色譜工作站:AgilentChemStation(10.02A);XHF-1高速分散器(上海金達(dá)生化儀器有限公司);XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);80-2離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠);高速臺(tái)式離心機(jī)1612-1型高速離心機(jī)(上海金達(dá)生化儀器有限公司)。1.3i試驗(yàn)SD大鼠,♂♀各半,體重246～358g(膽汁排泄試驗(yàn))、195～210g(尿液和糞便排泄試驗(yàn)),II級(jí),由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(蘇)2002-0031。1.4試驗(yàn)藥物的制備精確稱取一定量的BCQB和輔料苯扎氯銨,加入生理鹽水至全部溶解后,用HCl調(diào)pH至4～6,再用生理鹽水稀釋至所需濃度,供動(dòng)物給藥用。1.5不同給藥劑量和藥物濃度對(duì)大鼠臟器臟器和糞便泄漏的影響(1)膽汁排泄:大鼠8只,♂♀各半。給藥前禁食但可自由飲水10h后,用烏拉坦麻醉(1.25g/kg,i.p.),仰位固定,做膽管插管引流術(shù)。收集給藥前膽汁作為空白對(duì)照,然后1次鼻腔給予3.0mg/kgBCQB(給藥劑型為BCQB滴鼻劑,規(guī)格為30mg/mL)。每只大鼠按體重不同給藥體積亦不同,每個(gè)鼻孔給藥體積為10μL左右,給藥方法是用注射器插入鼻孔3～5mm處注入藥液。收集給藥后0～2、2～4、4～6、6～8、8～12、12～24h的膽汁,按擬定方法測定膽汁中藥物的濃度。(2)尿液和糞便排泄試驗(yàn):大鼠8只,♂♀各半,置于代謝籠中。給藥前禁食但可自由飲水10h后,收集給藥前的尿液和糞便作為空白對(duì)照。大鼠用乙醚淺麻后1次鼻腔給予3.0mg/kgBCQB,給藥劑型和方法與膽汁排泄試驗(yàn)相同,收集給藥后0～4、4～8、8～12、12～24、24～48、48～72、72～120h尿液,準(zhǔn)確測量體積,經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定;收集給藥后0～12、12～24、24～48、48～72、72～120h糞便,加定量生理鹽水制成勻漿。按擬定方法測定尿液和糞便中藥物的濃度。1.6lc-esi-ms的測量條件1.6.1hplc測定條件流動(dòng)相:甲醇-(含40mmol/L醋酸銨和1%甲酸)水溶液(70:30,v/v);流速:0.8mL/min;色譜柱:LichrospherC18(dp5μm,4.6～250mmID,江蘇漢邦科技股份有限公司);柱溫:25℃。1.6.2hplc測定條件流動(dòng)相:甲醇-(含40mmol/L醋酸銨和1%甲酸)水溶液(75:25,v/v);流速:1.0mL/min;色譜柱:LichrospherC18(dp5μm,4.6～250mmID,江蘇漢邦科技股份有限公司);柱溫:25℃。1.6.3輔助電噴霧離子化離子檢測方式:選擇性離子檢測(SIM),裂解電壓:150V,離子極性:正離子(Positive),離子化方式:氣動(dòng)輔助電噴霧離子化(ESI)。檢測對(duì)象:BCQB,[M]+離子m/z330.2;1-乙基-苯環(huán)喹溴銨,[M]+離子m/z344.2。干燥氣流速:10.0L/min,霧化室壓力:45psig.,干燥氣溫度:350℃,毛細(xì)管電壓:3KV。1.7滌綸樣品的提取和測定(1)膽汁樣品的處理:取膽汁0.2mL,加入1-乙基-苯環(huán)喹溴銨標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)1.010μg/mL)20μL,旋渦混勻,吸取0.2mL膽汁上C18固相萃取小柱(小柱在上樣前先用1mL甲醇活化,再用1mL水洗去甲醇),以1mL水洗脫,棄去洗脫液,再以2mL甲醇(含0.5%冰乙酸和0.5%三乙胺)洗脫,收集甲醇洗脫液,于37℃水浴以氮?dú)饬鞔蹈伞堅(jiān)?00μL流動(dòng)相溶解后,16000r/min離心5min,吸取上清液10μL進(jìn)行LC-MS分析,用樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比進(jìn)行定量分析。(2)尿液和糞便樣品的處理:取1mL糞便勻漿或尿液于離心管中,精密加入1-乙基-苯環(huán)喹溴銨標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)5.040μg/mL)20μL,旋渦混勻,加入甲醇4mL,渦旋3min,4000r/min離心10min,吸取4.0mL上清液于另一干凈離心管中,37℃水浴以氮?dú)饬鞔抵劣嗨畬?約0.5mL),上C18固相萃取小柱(小柱在上樣前先用1mL甲醇活化,再用1mL水洗去甲醇),上樣后以1mL水洗脫,棄去洗脫液,再以2mL甲醇(含0.5%冰醋酸和0.5%三乙胺)洗脫,收集甲醇洗脫液,于37℃水浴以氮?dú)饬鞔蹈?。殘?jiān)?00μL流動(dòng)相溶解后,16000r/min離心5min,吸取上清液30μL進(jìn)行LC-MS分析,用樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比進(jìn)行定量分析。2結(jié)果2.1理論與實(shí)踐的確認(rèn)2.1.1空白樣品的制備取大鼠空白膽汁、尿液和糞便,除不加內(nèi)標(biāo)溶液外,其余按1.7項(xiàng)下的方法處理并分析,獲得空白樣品的色譜圖;將一定濃度的BCQB標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入大鼠的空白膽汁、尿液或糞便中,同法操作,獲得相應(yīng)的色譜圖;同法得到給藥后膽汁、尿液和糞便樣品的色譜圖(圖2～4)。結(jié)果表明膽汁、尿液和糞便中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾BCQB和內(nèi)標(biāo)的測定。2.1.2標(biāo)準(zhǔn)含藥新生兒和糞便中bcqb的量限精密吸取不同量的BCQB標(biāo)準(zhǔn)液置于數(shù)支離心管中,吹干后分別加入空白膽汁0.2mL、空白尿液或糞便勻漿1mL,旋渦30s混勻,配成的濃度分別為30.15、100.50、201.00、301.50、603.00、1005.00、1507.50ng/mL的BCQB標(biāo)準(zhǔn)含藥膽汁,尿液和糞便均配成濃度分別為3.02、10.05、30.15、100.50、201.00、301.50、603.00、1005.00、1507.50ng/mL的BCQB標(biāo)準(zhǔn)含藥糞便勻漿或尿液樣品,按1.7項(xiàng)下處理后進(jìn)樣,以生物樣品中BCQB濃度(C)為橫坐標(biāo),BCQB和內(nèi)標(biāo)峰面積比(Y)為縱坐標(biāo),用加權(quán)(1/C)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得回歸方程如下:膽汁:Y=0.1055+0.008575×C(權(quán)重系數(shù)w=1/C)r=0.9995(n=7)尿液:Y=0.01711+0.007908×C(權(quán)重系數(shù)w=1/C)r=0.9997(n=9)糞便:Y=0.03819+0.007576×C(權(quán)重系數(shù)w=1/C)r=0.9995(n=9)按上述條件測得BCQB在膽汁中的定量下限為30.15ng/mL,尿液和糞便勻漿中的定量下限均為3.02ng/mL。2.1.3實(shí)際樣品檢測精密吸取不同量的BCQB標(biāo)準(zhǔn)液置于數(shù)支離心管中,吹干后加入0.2mL空白膽汁或1mL空白尿液或糞便勻漿,旋渦30s混勻,配成低(30.15ng/mL)、中(301.50ng/mL)、高(1507.50ng/mL)3個(gè)濃度的膽汁樣品各5批;配成低(3.02ng/mL)、中(301.50ng/mL)、高(1507.50ng/mL)3個(gè)濃度的尿液或糞便樣品各5批,按1.7項(xiàng)下處理后分析測定,與加入的實(shí)際濃度比較,計(jì)算相對(duì)回收率,膽汁、尿液和糞便的相對(duì)回收率為95.2%～104.1%。配制低(30.15ng/mL)、中(301.50ng/mL)、高(1507.50ng/mL)3個(gè)濃度的膽汁樣品,并配制低(3.02ng/mL)、中(301.50ng/mL)、高(1507.50ng/mL)3個(gè)濃度的尿液或糞便樣品,同日處理測定5批,計(jì)算批內(nèi)RSD;每日測定1批,并隨行1條標(biāo)準(zhǔn)曲線,連續(xù)3批,計(jì)算批間RSD,結(jié)果見表1。由表中結(jié)果可見,準(zhǔn)確度和精密度均符合生物樣本的分析測試要求。2.1.4提取回收率測定配制低(30.15ng/mL)、中(301.50ng/mL)和高(1507.50ng/mL)3個(gè)濃度的膽汁樣品,配制低(3.02ng/mL)、中(301.50ng/mL)和高(1507.50ng/mL)3個(gè)濃度的尿液或糞便樣品,每個(gè)濃度各5份樣品,以樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(fx)與對(duì)照樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(fs)計(jì)算提取回收率,對(duì)照樣品未經(jīng)過提取直接進(jìn)入LC-ESI-MS分析測定。膽汁的提取回收率:R%=fx/fs×100%,尿液和糞便的提取回收率:R%=fx/fs×5/4×100%,提取回收率的結(jié)果見表2,由表2結(jié)果可見,提取回收率符合生物樣本分析測試要求。2.1.5處理工藝或糞樣配制低(30.15ng/mL)、高(1507.50ng/mL)2個(gè)濃度的膽汁樣品,配制低(3.02ng/mL)、高(1507.50ng/mL)2個(gè)濃度的尿液或糞便樣品,用于考察穩(wěn)定性。每一條件的穩(wěn)定性考察的每一濃度水平進(jìn)行3樣本分析,按1.7項(xiàng)下處理后,采用LC-ESI-MS法測定。數(shù)據(jù)表明BCQB經(jīng)立即測定、室溫放置10h、反復(fù)凍融3次和-20℃下冷凍保存3周均穩(wěn)定,其測定準(zhǔn)確度在規(guī)定的85%～115%內(nèi)。2.1.6不同基質(zhì)效應(yīng)液質(zhì)中存在的介質(zhì)效應(yīng)是個(gè)很普遍的問題,它能產(chǎn)生離子抑制和增強(qiáng),從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在分析膽汁、尿液和糞便樣品時(shí),一些樣品的濃度已經(jīng)超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限(1507.50ng/mL),必須要用相同的空白基質(zhì)稀釋后測定,故對(duì)稀釋后的樣品是否產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察。膽汁、尿液和糞便樣品中BCQB的濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線上限的,用相同的空白基質(zhì)稀釋1、4、5倍;配制低(30.15ng/mL)、中(301.50ng/mL)、高(1507.50ng/mL)3個(gè)濃度的膽汁質(zhì)控樣品各5份,配制低(3.02ng/mL)、中(301.50ng/mL)、高(1507.50ng/mL)3個(gè)濃度的尿液或糞便質(zhì)控樣品各5份,用相應(yīng)的空白基質(zhì)稀釋1、4、5倍,分析測定其精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果表明,樣品的準(zhǔn)確度在±15%之內(nèi),稀釋因子的精密度<15%。2.2排水2.2.1gbcqb后汁液泄漏情況大鼠一次鼻腔給予3.0mg/kgBCQB后膽汁排泄情況見圖5A。在0～24h內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)占給藥總量的0.21%的原型藥物從膽汁中排出。2.2.2原型藥物在尿中的釋放量大鼠一次鼻腔給予3.0mg/kgBCQB后尿液和糞便的排泄情況見圖5B、C。在0～120h內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)少量的原型藥物從尿液中排出,占給藥總量的0.80%,0～120h內(nèi)占給藥總量的15.82%的原型藥物從糞便中排出。大鼠鼻腔給予3.0mg/kgBCQB排泄試驗(yàn)顯示原型藥物從膽汁、尿液和糞便中的排泄共占給藥總量的16.8%,表明83.2%的BCQB在體內(nèi)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化而排出體外。3生物樣品的分析和效率BCQB的季銨基是一個(gè)陽離子基團(tuán),比起其它含有羧基、仲胺、叔胺、酰胺的有機(jī)藥物,BCQB在電噴霧之前就已經(jīng)在流動(dòng)相內(nèi)充分離子化了,有利于提供豐富的BCQB離子從而提高質(zhì)譜響應(yīng)。同時(shí),BCQB中有弱極性基團(tuán),使BCQB具有表面活性,因?yàn)镋SI的機(jī)制假定為一種表面離子化技術(shù),具有表面活性的化合物(例如去污劑)具有最高響應(yīng),而且它們占據(jù)了液滴的表面,最容易生成氣態(tài)離子,質(zhì)譜響應(yīng)非常強(qiáng),最適合于用LC-ESI-MS測定。在參考文獻(xiàn)9和本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的血漿中BCQB濃度測定方法的基礎(chǔ)上,建立了LC-ESI-MS法測定膽汁、尿液和糞便中BCQB的濃度。生物樣品經(jīng)過C18小柱提取、純化和富集,可以去除生物介質(zhì)中雜質(zhì)的干擾,而且提取回收率較高(≥85.0%);方法學(xué)評(píng)價(jià)的結(jié)果表明,該方法準(zhǔn)確度好,精密度高、靈敏度高和分析快速,生物樣品在10min內(nèi)分析完畢。由于膽汁中內(nèi)源性雜質(zhì)或代謝產(chǎn)物的干擾較大,流動(dòng)相的比例為甲醇-(含40mmol/L醋酸銨和1%甲酸)水溶液(75:25,v/v),流速