一株抗參銹腐病菌的丹參菌株f05發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

一株抗參銹腐病菌的丹參菌株f05發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

西洋參銹腐病是對西洋參栽培過程中造成的嚴(yán)重疾病，主要是由破壞柱菌cylimatendetrocan引起的土壤傳播病。一般年發(fā)病率在30%左右,嚴(yán)重地塊高達(dá)70%以上?；疾⒏兩癄€,幾乎失去藥用價值和商品價值。對西洋參病害的防治,國內(nèi)外多采用化學(xué)防治,1年需施藥10余次。大量化學(xué)農(nóng)藥的施用,不但污染環(huán)境,而且?guī)磙r(nóng)藥殘留問題,降低了品質(zhì)以及經(jīng)濟效益。本實驗篩選了病原菌的拮抗放線菌并對其進(jìn)行了培養(yǎng)基的優(yōu)化,同時探討了生產(chǎn)上常用的農(nóng)藥與放線菌復(fù)配的可行性,以期實現(xiàn)對西洋參銹腐病進(jìn)行綜合防治。1材料和方法1.1糖培養(yǎng)基的制備分離與篩選培養(yǎng)基:高氏1號培養(yǎng)基;發(fā)酵種子培養(yǎng)基:液體馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基;原始發(fā)酵培養(yǎng)基:麥麩3%,豆餅粉1.5%;發(fā)酵培養(yǎng)基:本實驗篩選的碳源為麥麩、玉米粉、玉米秸稈粉,氮源為豆餅粉、脲、磷酸氫二銨,無機鹽為硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、氯化鈉。1.2材料的分離選好采集地點后,鏟去表層土,四分法取樣,裝入無菌牛皮紙袋中,帶回實驗室盡快分離。放線菌的分離參照文獻(xiàn)方法,其篩選參照文獻(xiàn)采用稀釋平板法對土樣進(jìn)行分離,并篩選出對西洋參銹腐病菌的抑制率最大的菌株。抑制率=對照菌落半徑?處理菌落半徑對照菌落半徑?原菌餅半徑=對照菌落半徑-處理菌落半徑對照菌落半徑-原菌餅半徑1.3菌種的活化將篩選出的菌株培養(yǎng)于試管中,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ们坝?2℃培養(yǎng)箱活化48h,將活化好的菌種擴繁于90mm的培養(yǎng)皿中。接種時,將平板菌種接種于盛有200mL無菌培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,每培養(yǎng)皿接種3瓶,于32℃,140r·min-1振蕩培養(yǎng)48h。1.4培養(yǎng)基的培養(yǎng)取5mL發(fā)酵種子液,接入盛有45mL無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,每個處理3次重復(fù)。置搖床中32℃,140r·min-1振蕩培養(yǎng)120h。培養(yǎng)結(jié)束后,取樣測定活菌生物量(CFU·mL-1)。1.5菌落計數(shù)培養(yǎng)混皿法,每個處理3個稀釋梯度,每個稀釋梯度5個平行,32℃培養(yǎng)48h,進(jìn)行菌落計數(shù)。實驗結(jié)果使用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。1.6發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗1.6.1不同碳源對菌株發(fā)酵的影響以原始發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的含碳量為標(biāo)準(zhǔn),分別用玉米粉、玉米稈粉對原始培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行替換,其余組分不變,測定不同碳源對優(yōu)選菌株發(fā)酵生物量的影響。1.6.2氮源種類對發(fā)酵生物量的影響分別用脲0.16g、磷酸氫二銨0.36g、豆餅粉0.75g、磷酸氫二銨0.75g、尿素0.75g以及0.25g豆餅粉+0.052g脲+0.12g磷酸氫二銨的組合對原始培養(yǎng)基中的氮源進(jìn)行替換,其余成分不變,測定不同氮源對優(yōu)選菌株發(fā)酵生物量的影響。1.6.3無產(chǎn)階級篩選在原始發(fā)酵培養(yǎng)基中加入無機鹽,其余成分不變,測定不同無機鹽對優(yōu)選菌株發(fā)酵生物量的影響。1.7分組配比的確定在發(fā)酵培養(yǎng)基配方單因素試驗的基礎(chǔ)上,用均勻設(shè)計確定培養(yǎng)基各組分的配比,采用4因素7水平7組試驗的方式,即U7(74)的設(shè)計方案,每組試驗3個平行。按1.4進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),用1.5方法測定活菌生物量,使用DPS軟件進(jìn)行回歸分析。1.8制備農(nóng)藥懸浮液選取目前生產(chǎn)上常用的5種農(nóng)藥,代森錳鋅、代森銨、乙膦鋁、多抗霉素、阿米西達(dá)進(jìn)行放線菌的農(nóng)藥耐受性試驗。將農(nóng)藥按所需稀釋倍數(shù)配成溶液,備用。取培養(yǎng)好的菌種用100mL無菌水洗下,制成孢子懸浮液,備用。向200mL馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中加入10mL上述孢子懸浮液,鋪成平板,待冷卻凝固后,放入牛津杯,并加入上述5種農(nóng)藥的不同稀釋倍數(shù)的藥液,25℃培養(yǎng)3d,用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。2結(jié)果與分析2.1生防菌f06-f9對婦人費氏原螯蝦的防效用平板稀釋法共分離到放線菌28株,將初選中有較好拮抗效果的5株放線菌進(jìn)行復(fù)篩。結(jié)果見表1,拮抗菌F05對西洋參銹腐菌的抑制效果最好,菌落半徑達(dá)到8.52mm,抑制率達(dá)到90.90%。其次F06菌落半徑為9.86mm,F19,F22菌落半徑為14.48,16.56mm,而生防菌F11的防效最差,菌落半徑達(dá)到19.22mm。因此本實驗選擇菌株F05作為發(fā)酵對象。2.2抗逆反應(yīng)型f052.2.1培養(yǎng)基蛋白的濃度以玉米稈粉為碳源的培養(yǎng)基活菌生物量最多,達(dá)到1.99×108CFU·mL-1。經(jīng)0.01水平顯著性分析,已達(dá)到極顯著水平,其次為麥麩1.19×108CFU·mL-1,玉米粉僅為4.2×107CFU·mL-1。這可能是因為培養(yǎng)基中加入玉米粉后,培養(yǎng)液會變得很黏稠,導(dǎo)致溶氧量降低,從而降低了活菌生物量。因此選擇玉米稈粉做碳源。2.2.2氮的來源以磷酸氫二銨為氮源的培養(yǎng)基活菌生物量最多,已達(dá)到3.03×108CFU·mL-1,經(jīng)0.01水平顯著性分析,已達(dá)到極顯著水平。2.2.3細(xì)菌活菌生物量經(jīng)0.01水平顯著性分析可知,在5種無機鹽中,碳酸鈣抑制菌體生長,與對照相比差異顯著;氯化鈉和硫酸亞鐵與對照相當(dāng),差異不顯著;而硫酸鎂和磷酸氫二鉀促進(jìn)了菌體的生長,活菌生物量分別達(dá)到1.87×108,4.07×108CFU·mL-1,差異極顯著。因此,將硫酸鎂、磷酸氫二鉀作為該培養(yǎng)基的無機鹽成分。2.3培養(yǎng)基配方優(yōu)化本試驗選用U7(74)均勻設(shè)計表,考察玉米稈粉、磷酸氫二銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂4種因子不同水平對F05菌體生長量的影響,見表2。用DPS軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次逐步回歸分析,得出活菌生物量與各因素關(guān)系的方程Y=-188.3993+150.8510X1-21.0265X12+129.3979X1X3-2458.9638X2X3+55742.1070X3X4,決定系數(shù)R2=0.9991,F=245.5638,P<0.05,該回歸方程具有統(tǒng)計學(xué)意義。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為:X1為玉米稈粉3.7206%,X2為磷酸氫二銨0.3003%,X3為硫酸鎂0.0400%,X4為磷酸氫二鉀0.0400%,理論活菌生物量為1.6070×109CFU·mL-1。用相同的試驗方法,采用最優(yōu)培養(yǎng)基組分做重復(fù)試驗,得到活菌生物量15.7×108CFU·mL-1。因此,上述試驗數(shù)據(jù)是合理的,采用均勻設(shè)計的方法是可行的,能減少試驗次數(shù),而且得到最優(yōu)的試驗參數(shù)。2.4抑菌圈的測定5種農(nóng)藥中代森銨、代森錳鋅對放線菌的生長均有較強抑制作用,乙膦鋁抑制作用較弱,而多抗霉素、阿米西達(dá)未產(chǎn)生抑菌圈,即這2種農(nóng)藥對放線菌無抑制作用。因此,在生產(chǎn)中可將這2種農(nóng)藥與放線菌復(fù)配使用,見表3。3秸稈生物利用技術(shù)本試驗在培養(yǎng)基組分篩選時沒有考慮精細(xì)原料,而是以粗放原料為篩選對象,并得到以玉米秸稈為碳源,磷酸氫二銨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基,為實現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。據(jù)報道,我國每年可生產(chǎn)秸稈7億噸。近年來,秸稈已經(jīng)由傳統(tǒng)的燃料、飼料、肥料變?yōu)橐环N無用的負(fù)擔(dān)物,進(jìn)而又造成秸稈就地焚燒日趨嚴(yán)重,煙霧彌漫,既污染環(huán)境又嚴(yán)重影響了交通安全。因此,合理利用秸稈十分必要。本實驗以玉米秸稈作為碳源,發(fā)酵放線菌,在實現(xiàn)對西洋參進(jìn)行生物防治的同時,也為秸稈的高價值轉(zhuǎn)化提供了新的思路。關(guān)于氮源的篩選,本實驗從豆餅粉、脲、磷酸氫二