鼠李糖乳桿菌產(chǎn)l-乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

鼠李糖乳桿菌產(chǎn)l-乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

硫酸及其衍生物在許多食品、藥物、輕化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在啤酒釀造中,乳酸作為風(fēng)味劑改善啤酒的口味并能起到延長啤酒保質(zhì)期的功效。在醫(yī)藥行業(yè)中,由乳酸制成的手術(shù)縫合線,使藥物通過擴(kuò)散等方式在一定時(shí)間內(nèi),以某種速率釋放到環(huán)境中。在煙葉生產(chǎn)中,乳酸可以調(diào)節(jié)煙草味,防止霉變。在農(nóng)業(yè)方面,乳酸可用于制備生物可降解塑料,延長農(nóng)藥作用時(shí)間,并對農(nóng)作物和土壤無毒害作用。近年來,利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸,因其具有條件可控、成本低等特點(diǎn)已成為目前L-乳酸的主要生產(chǎn)方法。本實(shí)驗(yàn)室多年來一直開展L-乳酸的研究,選育出一株產(chǎn)量高,穩(wěn)定性好的鼠李糖乳桿菌CLRID10(LactobacillusrhamnosusCLRID10)。本實(shí)驗(yàn)在確定鼠李糖乳桿菌碳氮源的基礎(chǔ)上,采用Minitab15中的Plackett-Burman設(shè)計(jì)從發(fā)酵條件各變量中找出對產(chǎn)量有影響的顯著性因素,再以顯著因子進(jìn)行中心組合試驗(yàn)(CCD),進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化,確定穩(wěn)定點(diǎn)的位置,得到最佳的發(fā)酵條件。1實(shí)驗(yàn)方法1.1材料表面1.1.1病毒鼠李糖乳桿菌CLRID10(LactobacillusrhamnosusCLRID10),本實(shí)驗(yàn)室保藏。1.1.2硫酸鎂、乙酸鈉、碳酸鈣5.2.斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.00,牛肉膏10.00,酵母膏5.00,葡萄糖20.00,檸檬酸氫二銨2.00,磷酸二氫鉀2.00,吐溫801.00,硫酸鎂0.58,硫酸錳0.25,乙酸鈉2.00,瓊脂20.00,碳酸鈣6.00,pH6.4,115℃滅菌30min。種子培養(yǎng)基(液體MRS,g/L):蛋白胨10.00,牛肉膏10.00,酵母膏5.00,葡萄糖20.00,檸檬酸氫二銨2.00,磷酸二氫鉀2.00,吐溫801.00,硫酸鎂0.58,硫酸錳0.25,乙酸鈉2.00,pH6.4,115℃滅菌30min。1.2方法1.2.1酸解硫酸酸解發(fā)酵液中L-乳酸的含量采用SBA-40C生物傳感分析儀進(jìn)行測定。在乳酸發(fā)酵液中加入過量的CaCO3,等反應(yīng)完全后取發(fā)酵液10mL,經(jīng)過7000r/min離心10min后取上清液1mL,加入19mL0.1mol/L的硫酸水溶液進(jìn)行酸解,過濾除去硫酸鈣,取1mL濾液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,然后按照生物傳感分析儀的使用方法測定。1.2.2單因素試驗(yàn)及中心試驗(yàn)發(fā)酵條件的優(yōu)化是在實(shí)驗(yàn)中確定的,溫度43℃、pH值6.9、周期84h、接種量10%、裝液量50mL/250mL,同時(shí)采用單因素對C、N源進(jìn)行優(yōu)選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)、中心復(fù)合設(shè)計(jì)和驗(yàn)證試驗(yàn)。通過碳氮源的優(yōu)選試驗(yàn),得到葡萄糖、酵母膏為最佳碳氮源。(1)l-乳酸測定采用N=5的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì),篩選出其中影響L-乳酸產(chǎn)量的顯著性因素,靜置發(fā)酵培養(yǎng)后測定L-乳酸含量,考察高低兩水平下L-乳酸的含量。(2)培養(yǎng)基的復(fù)合優(yōu)化對Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選出的較大影響因素,利用中心復(fù)合設(shè)計(jì)(CCD)對培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。然后使用Design-Expert7.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析,計(jì)算得到極值點(diǎn),確定最后的優(yōu)化結(jié)果。(3)試驗(yàn)步驟采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)得到的最佳培養(yǎng)基,進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),對真實(shí)性和正確性加以驗(yàn)證。2結(jié)果與討論2.1最優(yōu)培養(yǎng)基的確定本試驗(yàn)根據(jù)鼠李糖乳桿菌生長所需要營養(yǎng)要素并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,選取14個(gè)影響因素根據(jù)均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),從中篩選出9個(gè)顯著性影響因素。在經(jīng)過爬坡和中心復(fù)合設(shè)計(jì)篩選出5個(gè)顯著性影響因素。本試驗(yàn)是根據(jù)L0發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的最優(yōu)培養(yǎng)基為基礎(chǔ),再采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選D10菌株產(chǎn)L-乳酸的顯著性影響因素。以L-乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)量,將表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。從回歸分析結(jié)果來看,X1(葡萄糖)、X2(檸檬酸氫二銨)、X3(乙酸鈉)、X4(酵母膏)的p值在80%置信水平以上,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。而且,由表3可知,該方程的決定系數(shù)為(R2)=83.95%,說明回歸方程可以解釋高達(dá)83.95%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2.2中央復(fù)合設(shè)計(jì)cd2.2.1可預(yù)測菌株的實(shí)際發(fā)酵由表5、表6可知,實(shí)驗(yàn)所選用的模型顯著(P<0.0001)預(yù)測值和實(shí)測值之間有高相關(guān)性(R2=79.69%),能對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行較好的擬和,因此該模型可用于預(yù)測菌株的實(shí)際發(fā)酵。從表6可以看出,在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi),X1對L-乳酸產(chǎn)量的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.0001),X2X4、X2112的影響達(dá)顯著水平(P<0.05),而其它因素對L-乳酸產(chǎn)量的影響不顯著,從而確定出優(yōu)化的回歸方程:Y(g/L)=96.51+5.58X1+0.82X4-2.21X2X4+1.52X2112式中:Y——L-乳酸產(chǎn)量X1——葡萄糖X2——檸檬酸氫二銨X3——乙酸鈉X4——酵母膏2.2.2回歸方程響應(yīng)值Y在試驗(yàn)區(qū)域中有個(gè)穩(wěn)定點(diǎn)X1=138.8g/L,X2=2.19g/L,X3=6g/L,X4=7.56g/L,X5=0.50g/L代入回歸方程Y=108.40g/L。從圖1可知,由響應(yīng)面值的變化的趨勢,分析穩(wěn)定值的性質(zhì),確定該穩(wěn)定點(diǎn)為極大值點(diǎn),從而確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖:138.8g/L,檸檬酸氫二銨:2.19g/L,乙酸鈉:6g/L,酵母膏:7.56g/L,蛋白胨:0.50g/L。2.3測試測試采用最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),獲得的最大L-乳酸產(chǎn)量為104.40g/L擬合度很高。3檸檬酸氫二銨采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定了葡萄糖、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、酵母膏為顯著性影響因素。其中酵母膏的影響最顯著,其次是檸檬酸氫二銨。采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)優(yōu)化了回歸方程,從而確定出優(yōu)化的回歸方程