基于懸浮芯片技術的5種多病原菌病毒檢測方法的建立

基于懸浮芯片技術的5種多病原菌病毒檢測方法的建立

昆蟲病毒是指以吸血昆蟲為手段的病毒，通過動物、植物和動物傳播各種嚴重疾病。目前已發(fā)現(xiàn)的蟲媒病毒約537種,分布遍及世界五大洲,已證實其中130余種對人畜有致病性。目前,對于這類病毒的快速篩查還缺乏高通量、快速的檢測方法。懸浮芯片是近年來興起的一種檢測技術,與常規(guī)的病原分離鑒定、瓊脂擴散試驗、血凝和血凝抑制試驗、免疫熒光法和ELISA等實驗方法相比,它具有高通量、操作簡便、重復性好、靈敏度高以及線性范圍寬等優(yōu)點,特別適合于多病原體的高通量檢測及鑒定。本項研究擬建立一種基于懸浮基因芯片技術的可同時檢測1-4型登革病毒、乙型腦炎病毒、西尼羅病毒、森林腦炎病毒和黃熱病病毒等5種共8型病毒的檢測方法,為在媒介及人和動物標本中進行以上病原體的篩查和流行病學本底調查提供技術手段,為疾病的防治創(chuàng)造條件。1材料和方法1.1病毒rna的提取1-4型登革病毒(Denguevirus,DVⅠ～Ⅳ),日本乙型腦炎病毒(JapaneseBencephalitisvirus,JBEV),西尼羅病毒(westnilevirus,WNV),森林腦炎病毒(Tick-borneencephalitisvirus,TBEV),黃熱病病毒(yellowfevervirus,YFV),均由軍事醫(yī)學科學院微生物檢驗中心病毒室保存。BHK21和C6/36細胞為本所細胞室保存。DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司),胎牛血清(四季青生物制品公司);病毒RNA提取試劑盒(QIAGEN公司);AMV反轉錄酶(Promega公司);RNA酶抑制劑和ExTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司);懸浮芯片儀和色標微球(美國Luminex公司);雜交液氯化四甲銨(TMAC,Sigma公司)。本室收集和保存的標本有:豬腦標本14份,混合蚊蟲標本6份,人血清標本6份,人腦脊液3份,鼠腦接種標本4份,細胞傳代標本22份。1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)和復養(yǎng)DVⅠ～Ⅳ接種于C6/36細胞,而JBEV、WNV、TBEV和YFV接種于BHK21細胞。操作如下:用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液將保存的各病毒做1∶10稀釋,取1ml接種至長滿細胞單層的35cm2細胞瓶中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內吸附60min,然后加入細胞維持液5ml,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)。逐日在顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)情況,當90%以上細胞出現(xiàn)CPE時,收集病毒培養(yǎng)液,分裝后-40℃保存?zhèn)溆谩?.2.2吸棄劑和病毒液的制備采用空斑計數(shù)法測定。先將各病毒懸液稀釋至10-3、10-4、10-5濃度。于6孔板中挑選長成致密單層的BHK21細胞,吸棄培養(yǎng)液后用Earle氏液洗1次,將稀釋的病毒懸液分別加入細胞中,37℃吸附60min后吸出病毒液,每孔加營養(yǎng)瓊脂糖2ml,待凝固后,37℃倒置培養(yǎng)。逐日觀察細胞,待其開始出現(xiàn)CPE時加入含中性紅的第2層營養(yǎng)瓊脂,次日觀察出斑情況。1.2.3pcr擴增和雜交檢測在GenBank中收集已發(fā)表的以上5種病毒的全基因序列,利用DNAMAN6.0軟件進行序列比對及同源性分析,參照文獻設計屬通用擴增引物,再在靶序列的范圍內設計每種病毒的特異性檢測探針,用于PCR擴增后的雜交檢測。引物和探針均經(jīng)過Blast分析以驗證其特異性。引物和探針的序列見表1。引物及其生物素修飾由上海生工合成;探針的連接臂(C12)和氨基化由IDT公司合成。1.2.4修飾探針的連接按照Luminex公司的交聯(lián)程序,利用碳化二亞胺法將修飾有C12連接臂的氨基化探針共價交聯(lián)到羧基化的色標微球上,8種檢測探針分別交聯(lián)到不同編號的色標微球上,以利于多重檢測。1.2.5pcr檢測波長病毒RNA提取和反轉錄擴增按照試劑盒說明書進行。PCR反應體系組成如下:cDNA模板5μl,10μmol/L上下游引物各1μl,10×PCR緩沖液5μl,2.5mmol/LdNTP4μl,加水補至50μl。PCR反應條件:94℃預變性5min,然后94℃30s,52℃30s,72℃30s擴增,共35個循環(huán),最后72℃延伸10min。1.2.6改性co-ro首先制備混合微球工作液,用1.5×TMAC雜交液將8種已交聯(lián)探針的色標微球稀釋至150個/μl。向5μlPCR產(chǎn)物中分別加入12μlTE(pH8.0)和33μl混合微球工作液,混勻后于95℃變性5min、52℃雜交15min,將雜交液移至Millipore濾板上負壓抽空,加入75μl顯色液,52℃孵育5min后用Luminex200系統(tǒng)檢測。將BHK細胞培養(yǎng)液提取RNA和檢測樣本一起進行反應,作為背景對照,當待檢的平均熒光強度值為相應背景對照的兩倍以上時即可判定為陽性。1.2.7重復和特異性試驗分別提取8型病毒RNA行RT-PCR擴增,用建立的方法分別檢測8型病毒的通用引物擴增產(chǎn)物。在相同的實驗條件下,先后重復檢測3次。1.2.8基于luminx的病毒rna的檢測將JBEV、WNV和YFV培養(yǎng)液分別稀釋為104,103,102,101和100個PFU/ml,分別用140μl病毒液提取病毒RNA,用所建立的Luminex檢測方法進行檢測。1.2.9重組病毒rna的檢測對本實驗室收集和保存的山西豬腦組織標本、蚊蟲標本、人血清、人腦脊液、登革熱病人血清傳代標本和各病毒的培養(yǎng)上清等共55份,分別取140μl提取病毒RNA,用所建立的懸浮芯片方法進行檢測,并和病毒種特異的RT-PCR方法進行比對。2結果2.1探針的制備合成陽性對照序列,即和探針反向互補、5′端標記生物素的寡核苷酸,然后采用直接核酸雜交法進行檢測,以確證探針與色標微球的交聯(lián)情況。結果表明,8種探針均已正確交聯(lián)至特異的色標微球上。2.2反轉錄pcr擴增結果從病毒培養(yǎng)上清液中提取病毒RNA,用黃病毒屬通用引物進行反轉錄擴增,結果如圖1所示,表明通用引物對8型病毒均擴出了266bp的目的條帶。2.3熒光強度值的檢測3次檢測實驗的定性結果都完全正確,而且探針間也沒有交叉反應,各個平均熒光強度值的變異系數(shù)(CV)均在8%以內,表明該方法具有良好的特異性和可重復性。三次重復檢測結果見圖2。2.4檢測敏感性對5個梯度的病毒液的檢測結果表明,JBEV和YFV檢測敏感性可達1.4個PFU,而WNV的可達14個PFU,如圖3所示。2.5懸浮芯片檢測方法的比較收集的55份標本中,應用本方法共檢出乙腦陽性1份、西尼羅陽性1份、森林腦炎陽性1份、黃熱病陽性1份、登革1型陽性6份、登革2型陽性2份、登革3型陽性2份、登革4型陽性2份。而病毒種特異RT-PCR惟一有差別的是檢測出了2份乙腦病毒,其余結果均一致。和種特異的RT-PCR相比,懸浮芯片檢測方法的特異度為100%,準確度為98.2%(表2)。表明本方法的檢測結果和特異的RT-PCR具有很高的一致性,但是在高通量檢測中具有很大的優(yōu)勢。3浮片式懸浮藥物檢測目前,對蟲媒病毒的常規(guī)檢測方法主要為血清學方法和特異RT-PCR。常規(guī)的血清學方法對蟲媒病毒抗體、抗原檢測的敏感性和特異性不高,在病毒的分型鑒定中存在交叉反應;而RT-PCR檢測要求的環(huán)境條件苛刻,易出現(xiàn)假陽性結果。懸浮芯片是近年來新出現(xiàn)的一種可對多靶標同時進行定性、定量分析的新型芯片技術,它創(chuàng)新性地將細胞大小的微球作為檢測探針的載體,由于其檢測反應是在液相中進行,從而為生物反應提供了極佳的反應環(huán)境,大大提高了反應速度,并確保待檢核酸和蛋白保持自然構象。懸浮芯片不但具有普通生物芯片高通量的特性,而且操作簡便、重復性好、靈敏度高、靈活性大。該方法目前主要應用于蛋白質的多重檢測,在病原體核酸檢測中的應用還不多,已有用于人乳頭瘤病毒分型檢測的報道。本項研究根據(jù)GenBank上DV(1～4型)、JBEV、WNV、TBEV和YFV等5種病毒的核苷酸序列,結合DNAMAN6.0軟件和NCBIBlast分析,設計了黃病毒屬通用引物,并在擴增區(qū)內設計5種病毒的檢測探針,用于檢測以上5種蟲媒病毒,結果表明所建立的方法具有很好的重復性和特異性,而且其檢測敏感性可達到10個PFU左右。將本方法初步應用于臨床標本的檢測,和病毒種特異的RT-PCR檢測方法相比,檢測結果與其具有較高的一致性,但在快速、高通量