花椒中游離脂肪酸的微波提取及衍生化hplc熒光檢測

花椒中游離脂肪酸的微波提取及衍生化hplc熒光檢測

青椒是科的一種體裁，屬于“八味”之一。全世界花椒品種約250種,我國約有39種14變種。作為一種重要的香料和藥用經(jīng)濟作物,花椒種植規(guī)模每年以20%~30%的速度遞增,其綜合深度開發(fā)前景廣闊。在食品科學中,游離脂肪酸(FFA)含量水平不但是食品品質(zhì)的一項重要指標,而且對食品風味形成作用很大。因此,開發(fā)花椒FFA快速、高靈敏的提取和分析方法,對花椒原材料、生產(chǎn)加工以及相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制和研究開發(fā)具有重要意義。脂肪酸的提取方法有索氏法、溶劑法、超聲波提取、超臨界提取以及微波輔助提取法等。其中,微波輔助提取法具有提取時間短、溶劑消耗低、提取效率高,且易于操作和節(jié)能等優(yōu)點,具有很大優(yōu)勢。脂肪酸的分析方法較多采用甲酯化氣相色譜-質(zhì)譜法,其優(yōu)點是可進行數(shù)據(jù)庫檢索,缺點是甲酯化衍生反應(yīng)穩(wěn)定性差。雖有報導HPLC-MS直接檢測,但脂肪酸的質(zhì)譜離子化效率低,導致靈敏度和適用性有限。衍生化HPLC熒光檢測法具有較高靈敏度,已報導的熒光衍生試劑大多存在不同缺點,如穩(wěn)定性差、靈敏度低、操作繁瑣、分離干擾嚴重等。國內(nèi)報道了2-(11H-苯[a]咔唑)乙基對甲苯磺酸酯(BCETS)和苯并[b]吖啶酮-5-乙基對甲苯磺酸酯(BAETS)用于羧酸化合物分析,具有衍生效率高、產(chǎn)物穩(wěn)定、操作簡便、易于分離等優(yōu)點。本研究建立了微波輔助快速提取花椒FFA的技術(shù),并建立BAETS柱前衍生HPLC熒光檢測分析方法且進行檢測,為以花椒FFA作為品質(zhì)評價指標提供參考依據(jù),為花椒及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制標準提供技術(shù)支持。1材料和方法1.1試劑與儀器花椒樣品購自北京亞威中藥飲片有限公司(紅花椒,產(chǎn)品批號120801,產(chǎn)地四川),50℃恒溫鼓風干燥箱烘至恒重后,用粉碎機粉碎,過60目篩密封保存待用,本研究中所用花椒樣品均來自這同一份均一的粉碎樣品;石油醚、甲醇、乙醇、氯仿、正己烷等均為分析純,購自天津科密歐化學試劑有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)購自國藥集團,經(jīng)減壓蒸餾后使用;10種不飽和脂肪酸標品Sigma;9種飽和脂肪酸標準品上海試劑廠;色譜純乙腈德國Merck公司;其他試劑皆為分析純;純水Milli-Q超純水系統(tǒng)制備;苯并[b]吖啶酮-5-乙基對甲苯磺酸酯(BAETS)衍生試劑為合成,純度>99%,由曲阜師范大學化學與化工學院尤進茂教授研究組制備。Agilent1100型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent公司;IKAA11型食品粉碎機廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司;BF-2000型氮氣吹干儀北京八方世紀科技有限公司;XH-100A型微波催化合成/萃取儀北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。1.2實驗方法1.2.1baet衍生試劑和脂肪酸混標的制備準確稱取脂肪酸標品,配成0.01mol/L乙腈溶液。稱取適量BAETS衍生試劑用DMF定容至10mL,濃度0.01mol/L,低濃度衍生試劑和脂肪酸混標分別用DMF和乙腈稀釋使用。1.2.2脂肪酸衍生反應(yīng)BAETS對FFA的衍生按最優(yōu)化條件進行:在含10mgK2CO3的2mL安培瓶中依次加入200μLDMF,50μL混合脂肪酸(1.0×10-4mol/L),100μL衍生試劑溶液,封口后90℃水浴振蕩反應(yīng)30min,放置冷卻到室溫后,過濾膜并適當稀釋后進樣分析。該衍生液中脂肪酸標品進樣10μL,液相色譜熒光分析的進樣量為142.86pmol,依次稀釋進樣測定,在142.86~0.139pmol范圍內(nèi)進行線性回歸,制作標準曲線,以此實現(xiàn)對花椒樣品中FFA定量測定。1.2.3微波提取衍生測定對微波提取技術(shù)進行了提取溶劑、溫度、時間、功率的優(yōu)化考察,以建立快速有效的提取方法。簡要步驟如下:稱取0.2g上述花椒樣品,放入100mL的三口圓低燒瓶中,加入25mL氯仿/甲醇混合溶液,放入磁子,連接好控溫探頭和冷凝回流裝置,設(shè)定微波提取功率700W,溫度70℃,提取時間10min,待恢復到室溫后稱定質(zhì)量,精確移取過濾膜的提取液0.5mL于試管中,氮吹儀吹干后,用500μLDMF溶解用于衍生測定。1.2.4dmf的制備微波提取的樣品用優(yōu)化的衍生方法測定,保證使FFA被定量衍生。向盛有10mgK2CO3的2mL安培瓶中依次加入200μLDMF,100μL提取的DMF溶液,100μL衍生試劑溶液(0.01mol/L),封口后于90℃恒溫水浴下振蕩反應(yīng)30min,取100μL衍生液稀釋后進樣分析。1.2.5熒光定量和柱洗脫程序液相色譜條件:色譜柱為EclipseXDB-C8色譜柱(4.6mm×150mm,5μm,Agilent)。流動相A為50%乙腈水溶液(含10mmol/LHCOONH4,pH3.8),B:100%乙腈,C:乙腈(含0.2%甲酸)。流速1.0mL/min,進樣量10μL,柱溫30℃。熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為:λex=273nm,λem=505nm。梯度洗脫程序見表1。質(zhì)譜條件:大氣壓化學電離源(APCI),正離子模式,噴霧壓力413kPa,干燥氣流量為5L/min,干燥氣溫度350℃,氣化溫度450℃,毛細管電壓3500V,電暈電流4000nA(Pos)。2結(jié)果與討論2.1催化劑的衍生化效果FFA與BAETS的衍生反應(yīng)需在弱堿性有機溶劑環(huán)境中進行,隨溶劑不同產(chǎn)率有顯著差異。參照以往衍生化反應(yīng)的優(yōu)化方式,首先考察了碳酸鉀、草酸鉀、酒石酸鉀、檸檬酸鉀和醋酸鈉的催化效果,結(jié)果表明,使用10mgK2CO3做催化劑具有最高衍生產(chǎn)率,這與以往的研究報道相同。分別選取乙腈、DMF、四氫呋喃、二甲亞砜作為衍生溶劑體系進行考察,結(jié)果表明,DMF具有最大衍生化產(chǎn)率,且副反應(yīng)少。隨衍生溫度升高和時間延長,等量FFA衍生產(chǎn)物的峰面積會逐漸增加,在90℃反應(yīng)30min后衍生產(chǎn)物信號幾乎不再增加,因此,本研究統(tǒng)一選取90℃衍生反應(yīng)30min。2.2高效液相色譜條件優(yōu)化游離脂肪酸BAETS衍生物的色譜分離的難點在于多種長鏈不飽和脂肪酸與略低碳數(shù)的飽和脂肪酸出峰時間較為集中,給色譜分離帶來較大困難。在優(yōu)化初期,對比不同色譜柱和色譜條件,總有兩對FFA衍生物(C22∶6和C14,C18∶2和C15)難以徹底基線分離。從上述色譜柱中挑選最優(yōu)的EclipseXDB-C8色譜柱,再進行色譜條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在流動相中添加pH3.8的甲酸銨緩沖液,提供弱酸性流動相環(huán)境,能夠改善前半部分的脂肪酸衍生物的峰形和分離度。然而,后半部分衍生物柱上保留較強且分離度不高,在流動相C中添加0.2%甲酸后,明顯增強了流動相的洗脫能力且改善了后半部分脂肪酸衍生物的分離度,得到了能夠滿足外標法定量的分離結(jié)果,19種標準脂肪酸衍生物色譜分離見圖1。圖中前10min是BAETS在K2CO3作用下分解出的雜質(zhì)峰,不干擾后面FFA衍生物的分離和測定。同時,采用在線質(zhì)譜進行輔助鑒定,質(zhì)譜條件采用實驗部分所列參數(shù)即可得到很好的質(zhì)譜信號。2.3青椒提取條件優(yōu)化為建立快速有效的花椒FFA微波提取方法,考察了提取溶劑、微波功率以及時間和溫度的影響,在提取過程中一直開啟電磁攪拌功能。2.3.1樣品含量和提取率測定對微波輔助提取花椒FFA的溶劑進行了對比,在其他條件相同的情況下,考察石油醚、甲醇、乙醇、氯仿、正己烷、氯仿/甲醇(2∶1,1∶1,1∶2,V∶V)。設(shè)置溫度探頭70℃即可實現(xiàn)上述溶劑回流效果,提取和FFA測定按照實驗部分方法進行。結(jié)果表明,不同溶劑提取的FFA種類基本無差別,但提取率明顯不同。將每種溶劑提取所得游離脂肪酸BAETS衍生物的峰面積總和進行比較,如圖2所示,縱坐標值為每種溶劑體系所得脂肪酸總峰面積與提取率最高的氯仿/甲醇(1∶1,V∶V)總脂肪酸峰面積之百分比(%)。本研究采用氯仿/甲醇(1∶1,V∶V)作為微波提取FFA的溶劑。2.3.2微波功率對ffa衍生物峰面積的影響選用氯仿/甲醇(1∶1,V∶V)作為提取溶劑,在其他條件相同的情況下,對微波提取功率進行了對比考察。按照實驗部分的提取步驟進行,在300~1000W范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)隨著提取功率的增加,可以在更短時間內(nèi)完成提取。在提取時間為14~18min時,400~500W即可達到幾乎完全提取的效果,如果增加提取時間,在更低功率下仍可實現(xiàn)較高提取率。本研究目的是建立一種快速高效的提取方法,因此將提取時間定在10min進行考察。為達到花椒FFA的最大提取率,以900W提取兩次(每次10min,兩次峰面積之比為98.9∶1.1)的FFA衍生物峰面積總和作為完全提取的標準對照值,將每個功率下的峰面積與之對比作為縱坐標值(%),如圖3所示,當提取時間為10min時,微波功率在700~900W范圍內(nèi)能夠達到接近100%的提取率(均>98.2%),按照節(jié)能原則,實驗選用700W微波功率。因此,本研究最優(yōu)化微波提取條件為:采用氯仿/甲醇(1∶1,V∶V)作為提取溶劑,700W功率提取10min即可完成。2.3.3ffa總峰面積的測定為驗證上述最優(yōu)化條件的有效性,采用上述最優(yōu)化條件,以氯仿/甲醇(1∶1,V∶V)作為微波提取溶劑,功率700W提取10min,連續(xù)提取3次,分別測定每次所提取出的FFA總峰面積,3次的脂肪酸總峰面積之比為98.6∶1.1∶0.3。因此,上述最優(yōu)化條件第1次提取率達98%以上,可認為達到了完全提取。2.4ffa衍生物線性回歸方程在線性范圍142.86~0.139pmol(進樣10μL)范圍內(nèi),依據(jù)峰面積和實際進樣量(pmol)進行線性回歸,各FFA衍生物的線性回歸方程﹑相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。線性相關(guān)系數(shù)在0.9994~0.9999之間,檢出限在6.36~33.67fmol之間(S/N=3∶1)。2.5方法研究2.5.1色譜分析穩(wěn)定性將添加適量標準品的花椒粉末按照上述最優(yōu)微波提取條件進行提取,并按照實驗方法進行衍生和測定,衍生產(chǎn)物分別在室溫0、4、8、12、24、72h時進行色譜分析,峰面積的相對標準偏差(RSD)均低于2.90%,表明該方法具有較好的精密度,游離脂肪酸BAETS衍生物的穩(wěn)定性良好。2.5.2重復性檢驗取同一批6份上述加標后提取的樣品,進行樣品處理并進行重復性檢驗。結(jié)果顯示,重復性檢驗的峰面積相對標準偏差(RSD)為6.28%,表明本方法具有較好的重復性。2.5.3柱前衍生hplc熒光檢測在已知各FFA含量的花椒粉末樣品中,加入10μL混合脂肪酸(每種濃度1.0×10-4mol/L),按照提取和分析方法進行測定,計算各脂肪酸的回收率在87.60%~106.59%之間,這表明本研究建立的微波提取和柱前衍生HPLC熒光檢測法具有良好的準確性。2.6油酸衍生物的組成采用上述建立的微波快速提取法和BAETS衍生化HPLC熒光檢測法進行定量測定,同時進行在線質(zhì)譜輔助鑒定,這為HPLC熒光定量提供了更高的準確度?；ń窐悠分蠪FA含量結(jié)果見表3,樣品中FFA衍生物的色譜分離見圖4(A),代表性的油酸衍生物的一級質(zhì)譜圖為圖4(B),二級質(zhì)譜圖及其裂解模式歸屬見圖4(C)。結(jié)果表明,該花椒樣品中共檢測出9種FFA,其中油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、棕櫚酸(C16)和硬脂酸(C18)是花生油中的最主要的FFA成分,相對含量最高的是油酸,含量高達33.29%(374.09μg/g),依次是亞油酸(30.36%),棕櫚酸(18.70%)和硬脂酸(5.90%)。其中,不飽和脂肪酸占總FFA的70.75%,多不飽和脂肪酸占總FFA的33.96%(主要是亞油酸和α-亞麻酸,二者是人體不能自身合成的必需脂肪酸),因此,花椒FF