廣州市登革熱媒介白紋伊蚊的調(diào)查

廣州市登革熱媒介白紋伊蚊的調(diào)查

登陸熱是由登陸病毒引起的急性傳染病，通常在熱帶和亞熱帶地區(qū)傳播。該病傳播迅速,常常引起大規(guī)模流行,在南亞和東南亞地區(qū)短期內(nèi)登革熱發(fā)病人數(shù)可達(dá)數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)。地處亞熱帶的廣州市是我國(guó)登革熱的主要發(fā)生地之一,近十余年來(lái)多次發(fā)生登革熱的暴發(fā)、流行,疫情嚴(yán)重時(shí)患者人數(shù)達(dá)數(shù)千人之多。雖然本病近年來(lái)已引起廣泛重視,但是有關(guān)登革熱在我國(guó)亞熱帶地區(qū)發(fā)生、流行的來(lái)源及特點(diǎn)等方面仍有許多問(wèn)題值得探討和研究。為了了解廣州市自然界白紋伊蚊攜帶登革熱病毒情況,從2005年開(kāi)始,我們開(kāi)展了廣州市白紋伊蚊攜帶登革熱病毒情況的調(diào)查,首先由各個(gè)區(qū)縣疾控中心定期采集登革熱新舊疫點(diǎn)附近白紋伊蚊幼蟲標(biāo)本,然后對(duì)這些蚊蟲標(biāo)本進(jìn)行登革熱病毒檢測(cè)?，F(xiàn)將3年來(lái)的監(jiān)測(cè)結(jié)果報(bào)告如下。1材料和方法1.1白紋伊蚊幼蟲本從廣州市11個(gè)行政區(qū)的自然環(huán)境(包括外環(huán)境和民居室內(nèi),以登革熱新舊疫點(diǎn)為主)里的各種類型積水中采集白紋伊蚊幼蟲標(biāo)本,在實(shí)驗(yàn)室用酵母粉人工飼養(yǎng)為成蚊。1.2病毒登格迪布陽(yáng)性對(duì)照用登革熱病毒(廣州株)由本中心病毒免疫科提供。1.3en公司和tablesybrt-pcr試劑盒TRIzol試劑購(gòu)于Invitrogen公司,One-stepSYBRGreenreal-timeRT-PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司。1.4cttctctctctgctrtcactgctrtccttgctgcttgctgac3病毒檢測(cè)采用熒光RT-PCR方法,所用引物為自行設(shè)計(jì),其核苷酸序列為:上游引物:5’CTTTCCTCTTTCCTGCTTGCTAAC3’;下游引物:5’ATCCGTGACCATGCTCCTTATG3’。擴(kuò)增片段位于登革病毒E基因區(qū)域。1.5蚊子被檢測(cè)為攜帶登陸熱病毒1.5.1熒光定量rt-pcr檢測(cè)參照文獻(xiàn)介紹的方法:將蚊蟲冷凍麻醉后置于研磨杯中,加入1mlTRIzol試劑研磨后室溫靜置3min,再加入200μl氯仿,劇烈振蕩后靜置、離心,吸取上層水相轉(zhuǎn)移至另一離心管。加入等量異丙醇并混勻,室溫靜置后離心,棄上清;用75%乙醇洗滌,離心后去上清,真空干燥后溶解于20μl去RNase水中,立即進(jìn)行RT-PCR。采用TaKaRa公司一步法熒光定量RT-PCR試劑盒,在MJ-Research公司熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。50μl反應(yīng)體系中包含:PCR緩沖液25μl,逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl,Taq酶1μl,RNA酶抑制劑1μl,上、下游引物各1μl,RNA樣品5μl,加去離子水補(bǔ)齊余量。反應(yīng)步驟為:42℃逆轉(zhuǎn)錄15min,95℃預(yù)熱5min,95℃熱變性10s,60℃退火及引物延伸20s,50個(gè)循環(huán)后結(jié)束反應(yīng)并制作融解曲線。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,每次實(shí)驗(yàn)均同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(以廣州株登革熱病毒核酸為RT-PCR模板)和陰性對(duì)照(以純水為模板)。1.5.2序列分析出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的PCR產(chǎn)物送大連寶生物公司進(jìn)行序列測(cè)定,并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析。2結(jié)果2.1病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)2005~2007年,我們采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法總共檢測(cè)白紋伊蚊標(biāo)本493批,平均每批大約10余只蚊蟲。分別在荔灣區(qū)逢源街(2006年8月)、從化市鄧村(2007年4月)、白云區(qū)云溪(2007年5月)等地檢出登革熱病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本。其中荔灣區(qū)逢源街和從化市鄧村標(biāo)本的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)序列測(cè)定證實(shí)為登革病毒Ⅰ型,而白云區(qū)云溪標(biāo)本經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性,但未能進(jìn)行測(cè)序鑒定。2005年廣州未發(fā)生登革熱流行,白紋伊蚊標(biāo)本主要采自廣州市城區(qū),以登革熱舊疫點(diǎn)為主。共采集蚊蟲標(biāo)本2000余只,沒(méi)有檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。2006年廣州市發(fā)生了較大規(guī)模的登革熱流行,蚊蟲標(biāo)本主要采自登革熱疫點(diǎn)附近,共采集蚊蟲約2000只,其中在登革熱流行期采自疫點(diǎn)荔灣區(qū)逢源街的蚊蟲中檢出1份陽(yáng)性標(biāo)本。2007年廣州市沒(méi)有發(fā)生登革熱流行,僅有一些散發(fā)病例。在當(dāng)年出現(xiàn)首例登革熱病例之前分別在采自從化市鄧村、白云區(qū)云溪的蚊蟲中檢出2例陽(yáng)性標(biāo)本,其中從化市鄧村是2006年登革熱的主要疫點(diǎn)之一。2.2測(cè)序結(jié)果荔灣區(qū)逢源街標(biāo)本和從化鄧村標(biāo)本測(cè)序結(jié)果相同,核苷酸序列為:5’CTTTCCTCTTTCCTGCTTGCTAACTATCATGTGCGGCTCTCCCCCTCGTGTGGTCAGATGGAACGCCAGGGCTGTGGGCAGCAGCATAAGGAGCATGGTCACGGAT3’。核苷酸序列分析:經(jīng)過(guò)BLAST軟件進(jìn)行序列分析,證實(shí)該基因序列為登革熱病毒Ⅰ型序列。3基于檢測(cè)結(jié)果的登革熱病毒在非流行期的發(fā)生情況近年來(lái),關(guān)于廣州地區(qū)登革熱流行的來(lái)源問(wèn)題,多數(shù)報(bào)道認(rèn)為首例病例均為輸入性的,本地發(fā)生的登革熱流行是由輸入病例繼發(fā)引起的。廣州市自然界蚊媒中是否長(zhǎng)期存在登革熱病毒,在沒(méi)有登革熱病例輸入的情況下本地是否也可能發(fā)生登革熱流行的問(wèn)題,一直沒(méi)有直接的證據(jù)對(duì)此作出回答。但是近年來(lái)廣州市登革熱流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在廣州發(fā)生的登革熱流行存在著同一地點(diǎn)多年反復(fù)發(fā)生的特點(diǎn)。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)一些登革熱患者發(fā)病前并無(wú)外出史,且在當(dāng)?shù)匾矡o(wú)輸入性病例發(fā)生。這些現(xiàn)象提示人們,登革熱病毒有可能在廣州地區(qū)已經(jīng)長(zhǎng)期存在于自然界中,并且能在適當(dāng)條件下傳播給人群,造成登革熱的暴發(fā)、流行。而登革熱病毒在蚊蟲種群中的經(jīng)卵傳遞和經(jīng)交配傳遞能力以及登革熱病毒在滯育卵中的越冬能力則為這種觀點(diǎn)提供了理論依據(jù)。廣州市曾經(jīng)在2002年和2003年連續(xù)2年分別發(fā)生大規(guī)模和較大規(guī)模的登革熱流行,根據(jù)有關(guān)檢測(cè)結(jié)果,2002~2004年廣州地區(qū)流行的登革熱病毒株同源性完全一致,而與登革Ⅰ型病毒的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株相應(yīng)序列有95%的同源性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,2002年疫情的登革熱病毒延續(xù)到2003年的可能性很大。在登革熱的非流行期,于野外采集的白紋伊蚊體內(nèi)檢出登革熱病毒核酸則為這種觀點(diǎn)提供了直