我國登革病毒診斷方法的研究進(jìn)展

我國登革病毒診斷方法的研究進(jìn)展

登吉熱是由埃及蚊子和白紋蚊引起的急性病毒傳播的疾病?，F(xiàn)在，它是世界上嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前登革病毒診斷方法主要包括病毒分離、分子生物學(xué)檢測和血清學(xué)方法。其中,前者作為登革病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn),不但可以檢出病毒的存在,還能對病毒的型別進(jìn)行鑒定,但該方法比較耗時,而且需要一定的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員;從Banditti早期報道的巢式RT-PCT檢測到現(xiàn)在實時熒光PCR檢測的應(yīng)用以及核酸序列擴(kuò)增技術(shù),分子生物學(xué)檢測技術(shù)在這近十幾年來有了較大的發(fā)展,其敏感性、特異性和重復(fù)性都有了很大的提高,但該方法也存在較高的實驗室設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員要求;而利用抗原或抗體檢測原理的血清學(xué)實驗方法,具有操作方便、試劑廉價、診斷快速等特點,較適用于現(xiàn)場診斷,并得到了廣泛的應(yīng)用。登革病毒的血清學(xué)診斷方法主要包括血凝抑制(Hemagglutinationinhibition,HI)試驗,中和試驗(NeutralizationTest,NT)、間接免疫熒光抗體試驗(IndirectImmunofluorescentAssay,IIF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)、補(bǔ)體固定試驗(Complementfixation,CF)、斑點印跡、免疫層析法(ImmunochromatographicTest,ICT)等。這些方法主要就是對抗原(ELISA、斑點印跡、ICT)或者抗體(HI、NT、IIF、CF、ELISA、ICT、斑點印跡)進(jìn)行檢測。大量的應(yīng)用實踐發(fā)現(xiàn),目前最常用的方法主要為ELISA、ICT和比較傳統(tǒng)的HI試驗及NT試驗。1登革病毒中ns1基因的檢測在初次和二次感染的患者急性期血清中都可以通過酶聯(lián)反應(yīng)和斑點試驗檢測到高濃度、以免疫復(fù)合物形式存在的包膜蛋白(envelope,E)/膜蛋白(membrane,M)抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructuralprotein1,NS1)抗原,甚至在患者發(fā)病后9d仍能檢測到這些抗原。前者(envelope,E)是登革病毒的主要包膜蛋白,全長494個氨基酸,相對的分子量近60000;不但含有中和抗原表位、型特異表位,還有登革病毒種及黃病毒屬特異性表位。E蛋白的A、B兩區(qū)存在與中和抗體和血凝作用有關(guān)的抗體表位,可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體以及血凝抑制抗體。此外,該蛋白還可能會引起抗體依賴的增強(qiáng)感染作用(ADE),而ADE可導(dǎo)致DHF和DSS的產(chǎn)生。M蛋白(membrane,M)形成病毒毒粒的表面結(jié)構(gòu),分子量約為8000,由其前體PrM糖蛋白經(jīng)過特異性酶切后形成;研究發(fā)現(xiàn),M蛋白具有促進(jìn)病毒感染增強(qiáng)的作用。NS1蛋白屬于登革病毒中一種高度保守的非結(jié)構(gòu)性糖蛋白,具有較高的同源性,分為包內(nèi)型、膜型和分泌型。研究發(fā)現(xiàn)其抗原性很強(qiáng),含有多個T、B細(xì)胞表位,能夠誘發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,此外,在登革熱病人的血清中還存在較高水平的循環(huán)NS1抗原和NS1特異性抗體,且出現(xiàn)時間也早于IgM抗體。SophieAlco等人通過研究發(fā)現(xiàn),甚至在檢測不到登革病毒RNA或已有登革病毒IgM抗體存在的情況下,也可能有效檢測出NS1蛋白;他們對登革病毒感染者一出現(xiàn)發(fā)熱到臨床期結(jié)束的整個過程進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),登革病毒NS1蛋白均能在各個時間段內(nèi)的病人血清中檢測到,只不過各個時間段NS1蛋白滴度含量有所不同。目前針對E/M蛋白和NS1蛋白檢測的方法主要有ELISA和斑點免疫測定,其中ELISA法較為常用。2006年徐華等人采用DEN-1NS1抗原捕獲ELISA的方法,對16例臨床診斷為DEN1感染患者急性期的血清樣品進(jìn)行檢測;并把DEN-1NS1抗原檢測陽性樣本品15份與試劑盒IgM抗體(澳大利亞PanBio)檢測結(jié)果進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn),兩種方法檢測結(jié)果中有13例吻合(即IgM抗體和DEN1-NS1抗原檢測同時陽性);其余2例IgM抗體陰性,而DEN1-NS1抗原檢測呈陽性,結(jié)果提示該方法在登革熱的發(fā)病早期檢出效果可能要優(yōu)于IgM抗體的檢測。陳萬山等人分別采用傳統(tǒng)的病毒分離鑒定法、RT-PCR法以及IgM抗體檢測法與ELISA捕獲NS1抗原檢測法進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn),在登革病毒感染患者發(fā)病1～2d、3～5d以及6～10d的血清中,NS1抗原的檢出率分別是92.7%(38/41)、83.3%(70/84)、10.9%(5/46),特異性為100%;而IgM抗體檢測方法分別為2.4%(1/41)、51.2%(43/84)、97.8%(45/46),特異性為95.2%;RT-PCR法在發(fā)病的1～2d,與ELISA檢測NS1法結(jié)果的差異性不大(P>0.05);但病毒分離方法比NS1抗原方法的檢出率要低(P<0.05)。此外,PhilippeDussart采用ICT檢測NS1法(DengueNS1AgSTRIP)和兩步夾心格式微孔板ELISA檢測NS1法(pan-EDengueEarlyELISA)與一步夾心格式微孔板ELISA檢測NS1法(thePlateliaDengueNS1AgTest)進(jìn)行檢測比較發(fā)現(xiàn),DengueNS1AgSTRIP檢測法的敏感性和特異性分別為76.1%(207/272)和100%(48/48);而pan-EDengueEarlyELISA檢測法的敏感性和特異性分別為55.1%(150/272)和97.9%(47/48);thePlateliaDengueNS1Agtest的敏感性和特異性分別為82.4%(224/272)和100%(48/48)。該比較結(jié)果說明thePlateliaDengueNS1Agtest是三者中檢測效果最好的,可作為早期診斷DEN感染的方法。2關(guān)于局部感染的檢測登革感染者血清中的抗體檢測常見的有血凝抑制(Hemagglutination-inhibition)抗體、中和(Neutralization)抗體、IgM和IgG。其中,血凝抑制抗體是一種能夠抑制登革病毒促使紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象的特異性抗體,長期以來測定血凝抑制抗體的血凝抑制試驗(HI)被廣泛應(yīng)用于登革病毒感染的檢測。一般初次感染者急性階段的抗體多在發(fā)病后第5～6d才可檢測到(抗體滴度通常大于1∶10);而對于二或三次感染時,抗體滴度通常在發(fā)病后第1d就會迅速上升(一般大于1∶24),因此,急性期血清標(biāo)本抗體滴度在1∶1280以上時,提示近期有登革病毒感染。但最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),針對登革病毒的初次和二次感染者,HI試驗和EILSA試驗的檢測結(jié)果吻合率僅有88%,其原因還有待進(jìn)一步的研究證實。中和抗體是當(dāng)人體感染登革病毒后所產(chǎn)生的一種保護(hù)性抗體,可以抑制登革病毒的吸附、穿入、從而使其失去感染能力。傳統(tǒng)檢測中和抗體的實驗方法多為空斑減少中和試驗,該實驗具有較高的敏感性和特異性,特別是針對于初次感染的血清型鑒定。但對于二或三次感染者,由于原始抗原痕跡(originalantigenicsin,OAS)作用的存在,使中和抗體試驗的可靠性明顯降低。因此,該實驗只適用于初次感染的登革熱診斷。一般來說,初次感染登革病毒,IgM通常在發(fā)病后的5d出現(xiàn),1～3周內(nèi)達(dá)到高水平,并可維持2個月,有的甚至在6個月時還能檢測到;而IgG抗體的出現(xiàn)時間要比IgM晚,多在感染后的2周出現(xiàn),并可維持終生。在二次感染時,IgM則出現(xiàn)的比較晚,且所產(chǎn)生的水平也較低,維持的時間也不長,常使得一些患者較難檢測到IgM;而IgG的產(chǎn)生時間就很快,一般是在出現(xiàn)癥狀后的1～2d出現(xiàn),且抗體水平也比既往的要高。為此,在實際應(yīng)用中,對于初次登革病毒的檢測,IgM一般用于檢測發(fā)病后1周所采集的血液,發(fā)病2周后采集的血液就可以采取IgG抗體檢測;對于二次感染,在檢測可疑病人的血清時,建議同時檢測IgM和IgG兩種抗體。目前對兩種IgM和IgG抗體檢測的主要方法有ELISA法、ICT以及IIF(主要檢測IgG)。其中,以膠體金快速免疫層析法為代表的ICT檢測法是目前較常用的現(xiàn)場快速診斷方法。一方面它對登革熱的診斷速度快,僅需5～10min而且不需要特定的實驗室設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員,在現(xiàn)場就可以完成檢測;另一方面采用該方法既可檢測IgM,又可檢測IgG,而且對是否初次或二次感染都可做出初步判斷。Lam和Devine早在1998年就提出快速免疫層析法對早期快速診斷登革熱感染是非常有價值的。他們用快速免疫層析試驗和ELISA捕獲法在登革感染期間,對IgM和IgG抗體進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種方法的敏感性和特異性都較高,分別為100%和89%。DavidW.Vaughn和AnandaNisalak等人用ICT對登革病毒感染患者的血清檢測IgM和IgG抗體時發(fā)現(xiàn),其敏感性和特異性也分別高達(dá)100%和88%。何似、陳潤等人采用ICT和IIF對56份疑似登革熱病人的血清和68份無癥狀人群的血清分別進(jìn)行了IgG的檢測,在前者血清的兩種檢測方法比較中發(fā)現(xiàn),IIF法檢測的陽性率為53.6%(30/56),ICT檢測的陽性率為46.4%(26/56),兩法符合率91.07%,無顯著差異(P>0.05);但在后者血清的檢測中,IIF法檢查的陽性率為54.4%(37/68),而ICT檢測得陽性率為33.8%(23/68);兩法符合率73.53%,存在顯著差異(P<0.01)。此外,徐建民采用抗體捕獲ELISA法和快速免疫層析法分別對2000年的322份標(biāo)本(其中4份確診為登革熱病人)和1999年的311份標(biāo)本(其中2份確診為登革熱病人)進(jìn)行了檢測,通過對結(jié)果數(shù)據(jù)的比較揭示,快速免疫層析法特別適于在登革熱暴發(fā)流行期間作初篩試驗。3elisa在pcr檢測中的靈敏度和敏感性近十幾年來,血清學(xué)試驗技術(shù)有了迅速的發(fā)展,之間不斷有新的檢測技術(shù)出現(xiàn)。如捕獲NS1抗原的ELISA法,其靈敏值可達(dá)到10ng/ml。SophieAlcon等建立了類似檢測NS1蛋白的方法,參比蛋白采用1型登革病毒NS1蛋白,包被抗體和酶標(biāo)抗體分別為抗登革病毒1型鼠多克隆抗血清和兔多克隆抗血清,該方法甚至可以檢測到含量低于1ng/mL的DEN-1NS1蛋白,但同樣的檢測水平對于其它型的NS1蛋白不成立,其敏感性可低至10倍。這種差異可能是所用的多抗血清只針對DEN-1NS1蛋白,由于登革病毒NS1蛋白的氨基酸序列同源性并不是很高(一般不超過80%),使得該多抗血清與其它型的登革病毒NS1蛋白的反應(yīng)效率降低。因此,使用針對某一種型別的NS1抗原不但可以提高該型登革病毒檢測方法的靈敏性,還有可能對病毒的型別進(jìn)行鑒定。最近研究報道,針對于I型和III型登革病毒的NS1特異性單抗已經(jīng)成功制備;這些都預(yù)示著ELISA捕獲NS1抗原檢測法在未來可以作