登革病毒對人樹突狀細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響

登革病毒對人樹突狀細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響

感染登格病毒（dv）是亞洲、太平洋和美國熱帶和亞熱帶疾病的一種嚴(yán)重疾病，嚴(yán)重危及全球近一半人的健康。感染可引起自限性登革熱(denguefever,DF),也可導(dǎo)致危及生命的登革出血熱(denguehemorrhagicfever,DHF)及登革休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS),其發(fā)病機制至今不明,但已知免疫應(yīng)答在決定其疾病嚴(yán)重程度中起重要作用。在影響DHF/DSS病程發(fā)展中一個最顯著因素是登革病毒2次感染。目前認(rèn)為在2次病毒感染中,再次免疫應(yīng)答導(dǎo)致過量細(xì)胞因子(cytokine,CK)如IL-4、TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-γ等產(chǎn)生、補體活化及炎性分子釋放,從而引起DHF/DSS。樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)是目前所知機體內(nèi)功能最強的抗原呈遞細(xì)胞(antigenpresentingcell,APC),是激發(fā)初始T細(xì)胞和記憶細(xì)胞的主要APC,同時可產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子和其它化學(xué)介質(zhì)參與免疫調(diào)節(jié)。本研究以人髓系樹突狀細(xì)胞為靶細(xì)胞,探討登革病毒對其產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IFN-γ的作用。材料和方法1中毒植物和細(xì)胞登革Ⅱ型NewGuineaC株(DV-2NGC株)我室保存。白紋伊蚊C6/36細(xì)胞由本室傳代保存。2細(xì)胞毒和細(xì)胞增生藥粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-monocytecolony-stimulatingfactor,GM-CSF)、重組人白細(xì)胞介素-4(recombinanthumaninterleukin4,rhIL-4)、重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)(深圳晶美公司);鼠抗人CD1a單克隆抗體、MTT(北京中山生物技術(shù)公司);新生小牛血清(杭州四季青公司);RPMI1640、DMEM(Gibco公司);淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD研究所);SABC試劑盒(武漢博士德公司);ELISA試劑盒(Genzyme公司產(chǎn)品)。3細(xì)胞培養(yǎng)液制備無菌取新鮮外周血(健康獻(xiàn)血員)20-50mL,肝素抗凝(2×104U/L),淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC),用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液(含RPMI-1640、HEPES10mmol/L,青霉素、鏈霉素各1×105U/L、10%小牛血清)調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×1010cells/L,加入6孔板,每孔2mL,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h,吸棄上清,用PBS輕洗2次,去除非粘附細(xì)胞,獲得單核細(xì)胞,每孔再加入含GM-CSF100μg/L、IL-450μg/L1640完全培養(yǎng)基2mL,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),每隔3d半量換液,加入全量細(xì)胞因子。培養(yǎng)7-10d收集細(xì)胞并鑒定。4掃描電鏡觀察細(xì)胞接種蓋玻片(用多聚賴氨酸處理),干燥后PBS清洗5min×3,2.5%戊二醛固定2h,PBS清洗5min×5,乙醇梯度脫水(50%、70%、80%、90%乙醇各10min×1,100%乙醇15min×2),加醋酸異戊酯30min,CO2臨界點干燥、金屬鍍膜,掃描電鏡觀察。5免疫組織化學(xué)細(xì)胞加樣于玻片上(玻片用多聚賴氨酸處理),-20℃冷丙酮固定10min后,0.6%過氧化氫甲醇溶液室溫下孵育10min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性,滴加正常羊血清封閉液室溫20min,傾去血清后滴加鼠抗人CD1a抗體,置濕盒內(nèi)室溫2h,滴加羊抗鼠IgG二抗工作液,室溫孵育20min,滴加SABC試劑,室溫孵育20min。以上每個步驟間均以PBS沖洗2min×3。DAB顯色,光鏡下觀察反應(yīng)20min。流水清洗后,蘇木素復(fù)染,常規(guī)乙醇梯度脫水(70%、80%、90%乙醇5min×1,95%乙醇5min×2,100%乙醇5min×3),二甲苯透明,樹膠封片。PBS代替一抗作陰性對照,其余步驟同上。6異體細(xì)胞dc與效應(yīng)細(xì)胞比例的檢測參考文獻(xiàn),取正常人外周抗凝血,常規(guī)分離PBMC,PBS洗去血小板,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h,取懸浮細(xì)胞,用含濃度為200mL/LIL-2的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7d,作為同種異體淋巴細(xì)胞。DC用完全培養(yǎng)基懸浮,分別以4×104cells/well、2×104cells/well、1×104cells/well、4×103cells/well、2×103cells/well加入96孔板,每組設(shè)3個復(fù)孔,每孔再加入同種異體淋巴細(xì)胞2×105cells/well,終體積200μL(即DC與效應(yīng)細(xì)胞比例為1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h,加入MTT20μL/well,繼續(xù)孵育4h,離心(1000r/min,5min)棄上清,加入DMSO150μL/well,振蕩10min,測A值(λ=570nm)。7小鼠血清中dv-2的檢測DC懸液接種到24孔板,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至3×104cells/well,37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜,無血清RPMI1640液洗滌2次,感染DV-2,MOI為10pfu/cell,對照組加4%小牛血清的DMEM液。病毒吸附2h后,離心(800r/min,5min)去感染上清,10%小牛血清的RPMI-1640洗兩次,加入10%小牛血清的RPMI-1640200μL/well,置37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng),于感染后6、24、48、72、96h分別收集上清液,-20℃保存。ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ含量。8dv抗體檢測病毒感染方法同上,于收集上清同時收集感染細(xì)胞,置于玻片上,干燥后4℃丙酮固定10min,PBS清洗5次,每次5min,加1∶10稀釋的鼠抗DV抗體(一抗),PBS清洗5次,加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(二抗),免疫熒光顯微鏡下觀察,未感染DC作陰性對照。9統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,SPSS10.0處理數(shù)據(jù),采用重復(fù)測量分析和t檢驗法。結(jié)果1細(xì)胞表型和cd1a表達(dá)單核細(xì)胞培養(yǎng)3d出現(xiàn)細(xì)胞聚集形成散在的細(xì)胞集落,隨著時間延長細(xì)胞從聚體脫落呈懸浮生長,培養(yǎng)7d左右可見到大量典型的樹突樣突起的懸浮細(xì)胞,形態(tài)呈圓形、網(wǎng)球拍形、不規(guī)則形等,體積比單核細(xì)胞大1-1.5倍(圖1)。掃描電鏡觀察可見細(xì)胞表面有大量不規(guī)則突起(圖2),免疫組化CD1a陽性表達(dá)率達(dá)80%-95%左右(圖3)。DC刺激同種淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)表明本法獲得的DC具有強大的促進淋巴細(xì)胞增殖能力。2感染lc-登格病毒基因的檢測病毒感染24h出現(xiàn)熒光陽性細(xì)胞,48h達(dá)到高峰,在DC胞漿及胞膜上出現(xiàn)片狀或顆粒性綠色熒光(圖4)。3感染24h后各時段與對照組比較由表1可見登革病毒感染6h后,DC即開始分泌IL-6,在24h達(dá)到高峰,以后略有下降,維持在較高水平,感染24h后各時段與對照組均有顯著差異(P<0.01,P<0.05)。病毒感染6h后,DC開始分泌TNF-α,在病毒感染后48h達(dá)到高峰,隨之緩慢下降,在24、48、72h與對照組有顯著差異(P<0.01)。DC感染登革病毒后產(chǎn)生IFN-γ也在48h達(dá)到高峰,但各時段與對照組差異無顯著(P>0.05)。il-6與dv近年研究表明登革病毒感染引起機體分泌多種細(xì)胞因子,不同的細(xì)胞因子通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、影響病毒復(fù)制等機制在DHF/DSS發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Kittigul等發(fā)現(xiàn),DF病人血清中TNF-α含量顯著高于正常對照組;DHF病人TNF-α濃度顯著高于DF病人。Green等發(fā)現(xiàn),與DF病人相比,DHF/DSS病人血清中TNF-α、IFN-γ和可溶性TNF-α受體水平升高。江麗芳等研究表明,DV感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)后能產(chǎn)生大量IL-6和IL-8;且IL-6和IL-8水平主要是在DHF病人升高。Juffrie等發(fā)現(xiàn)DSS病人體內(nèi)IL-6含量明顯高于正常對照,休克病人IL-6水平又明顯高于血壓正常者;IL-6水平與腹水發(fā)生率呈正相關(guān)。登革病毒感染的靶細(xì)胞一般認(rèn)為是血單核細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞,Chen等研究發(fā)現(xiàn),登革病毒體外感染單核巨噬細(xì)胞可引起多種細(xì)胞因子分泌,然而這些細(xì)胞都不能有效地呈遞抗原給T細(xì)胞。髓系DC分布在表皮和上皮,是免疫應(yīng)答的始動者,可能是蚊蟲叮咬后機體啟動最初免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞。最近的研究證實,未成熟的髓系DC是登革病毒感染的靶細(xì)胞,DC-SIGN(DC-specificICAM-3-grabbingnonintegin)作為表達(dá)于表皮DC表面的甘露糖特異性C-型凝集素受體,不僅可介導(dǎo)HIV的高親合力感染,也是人DC感染DV的主要細(xì)胞受體。但有關(guān)病毒感染對DC的作用以及細(xì)胞因子在登革病毒感染DC中的作用了解不多。IL-6是一種重要的免疫分子,可促進B細(xì)胞分化和免疫球蛋白分泌,與IL-2、IFN-γ協(xié)同促進CTL分化。TNF-α的作用具有雙重性:TNF-α可選擇性殺傷病毒感染細(xì)胞;抑制病毒復(fù)制;增強未感染細(xì)胞對病毒的抵抗力;促進T和B細(xì)胞增殖分化;誘導(dǎo)多種有核細(xì)胞分泌干擾素,而起直接或間接抗病毒作用;TNF-α又可促進病毒繁殖,能使HIV、HSV等多種病毒的復(fù)制能力加強。TNF-α還可促進DC成熟,并表達(dá)CD83、HLA-I、HLA-II和共刺激分子。由此推測,病毒進入機體以后在DC內(nèi)復(fù)制,同時促進細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IL-6、TNF-α等,增高的細(xì)胞因子又可促進DC成熟和活化,誘發(fā)特異性T細(xì)胞活化進而促進細(xì)胞因子IFN-γ等的分泌,從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。值得注意的是,目前