登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns3npaserna解旋酶結(jié)構(gòu)域的表達(dá)及活性研究

登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns3npaserna解旋酶結(jié)構(gòu)域的表達(dá)及活性研究

近年來，登甲病毒（den）的流行形勢(shì)更加嚴(yán)峻。據(jù)報(bào)道，世界上大約25億人口受到了登甲病毒感染的威脅。目前尚無特異有效的疫苗和抗病毒制劑。登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3是一種多功能蛋白,N端具有Ser蛋白酶活性,C端具RNA解旋酶及NTPase、5′RNA三磷酸酶等活性,參與病毒前體的加工和病毒RNA的復(fù)制及基因組RNA的5′端加帽。NS3具有良好的免疫原性,存在多個(gè)登革病毒特異性CD4+、CD8+T細(xì)胞表位,且多具型間交叉免疫特性。登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3已成為有吸引力的抗病毒靶標(biāo)。本研究目的在于構(gòu)建DENNS3表達(dá)體系,獲得DENNS3表達(dá)產(chǎn)物,并對(duì)其活性作初步研究,為抗DEN制劑的篩選打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。重組質(zhì)粒的構(gòu)建病毒、細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒:登革2型病毒D2-43株引自本所病毒室;BHK-21細(xì)胞株本室保存;大腸桿菌BL21(DE3)本室保存;原核表達(dá)載體pET28a為Invitrogen公司產(chǎn)品;登革病毒NS5的原核表達(dá)載體pQE30-NS5本室構(gòu)建并保存。試劑:Trizol試劑GIBCO公司產(chǎn)品;金屬螯和親和層析柱(Ni-NTAagrose)購自德國QIAGEN公司;SuperScriptTMⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶Invitrogen公司產(chǎn)品;高保真PyrobestDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品;質(zhì)粒DNA純化試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒分別為Sigma和塞百盛公司產(chǎn)品,BCA蛋白濃度試劑盒為天象邦定公司產(chǎn)品。登革2型病毒小鼠免疫腹水抗體為本所病毒室惠贈(zèng);poly(A)為Sigma公司產(chǎn)品,其他試劑為國產(chǎn)分析純。引物:根據(jù)病毒株序列以DNAStar軟件設(shè)計(jì)引物,交上海生工生物有限公司合成,其序列為:F5002:5′-(NcoⅠ酶切位點(diǎn))GAACTCCATGGCATATGTGAGTGCTATAGCCCAGACT-3′,R6375:5′-(HindⅢ酶切位點(diǎn))CCGCAAGCTTCTTTCTTCCAGCTGCAAACTCCT-3′。表達(dá)載體的構(gòu)建RT-PCR擴(kuò)增登革2型病毒NS3NTPase/RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域編碼基因:以Trizol試劑提取的感染登革2型病毒的BHK-21細(xì)胞總RNA為模板,以DEN-2NS3蛋白編碼基因3′端引物R6375為反向引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),RT-PCR擴(kuò)增目的基因。循環(huán)參數(shù)為:94℃5min后,94℃30s,48℃30s,72℃90s,30個(gè)循環(huán),72℃延伸5min。重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ、HindⅢ雙酶切后,連入表達(dá)載體pET28a,CaCl2法轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)。篩選獲得的重組質(zhì)粒命名為pET28a-dNS3。分別用PCR和酶切分析對(duì)插入的dNS3片段進(jìn)行鑒定,并送上海生工生物有限公司測(cè)序。目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化:自培養(yǎng)板上挑取BL21(DE3)/pET28a-dNS3單菌落,轉(zhuǎn)入5ml含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃搖菌過夜。轉(zhuǎn)入500ml含卡那霉素的高濃度肉湯培養(yǎng)基中,于37℃劇烈搖菌至A600為0.6,加入IPTG至終濃度0.5mmol/L,繼續(xù)25℃培養(yǎng)6h。離心集菌,以10ml裂解緩沖液(20mmol/LTris-HCl,300mmol/LNaCl,10mmol/L咪唑)懸浮,加入溶菌酶至1mg/ml,加入苯甲磺酰氟(PMSF)至1mmol/L,超聲破碎。將裂解液上清與2mlNi-NTA樹脂混合,冰浴振蕩1h后倒入空柱中,待裂解液流出后以20ml洗液(20mmol/LTris-HCl,300mmol/LNaCl,20mmol/L咪唑)洗柱體,以10ml洗脫液(20mmol/LTris-HCl,300mmol/LNaCl,100mmol/L咪唑)洗脫表達(dá)產(chǎn)物,收集洗脫液。用Centricon-YM50超濾柱(Millipore)將洗脫液濃縮至0.5ml。BCA法測(cè)定蛋白濃度。表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot分析:SDS結(jié)束后,將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用3%牛血清白蛋白的TBST室溫封閉5h。TBST洗滌3次,每次5min,加入封閉液稀釋的小鼠抗D2-43腹水抗體(1∶100),室溫孵育2h。TBST洗滌10min×3,加入封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶500),室溫反應(yīng)2h。TBST洗滌3次,再以TBS洗滌2次。將膜置于新鮮制備的5ml生色液(含DAB3mg,30%H2O210μl,0.3%NiCl20.5μl)至出現(xiàn)清晰條帶。純化產(chǎn)物的NTPase活性檢測(cè):根據(jù)Henkel等人的方法,測(cè)量NTP水解釋放磷酸根(Pi)的數(shù)量以檢測(cè)活性。終止液測(cè)量前配置,組分為孔雀綠(質(zhì)量濃度為0.0812%)、聚乙烯醇(質(zhì)量濃度為2.32%,沸水配制)、鉬酸銨(質(zhì)量濃度為5.72%,溶于6mol/LHCl)、蒸餾水,以2∶1∶1∶2混合,室溫2h內(nèi)使用。反應(yīng)體系(50μl)包括酶純化產(chǎn)物、Tris-HCl(20mmol/L,pH7.0)、ATP、MgCl2等,室溫反應(yīng)20min,加終止液室溫作用5min后加25μl30%檸檬酸鈉室溫作用5min,酶標(biāo)儀測(cè)量630nmA值。酶量對(duì)dNS3ATPase活性的影響:反應(yīng)體系(50μl)包括酶純化產(chǎn)物、Tris-HCl(20mmol/L、pH7.0),2mmol/LATP、2mmol/LMgCl2,室溫反應(yīng)20min。酶純化產(chǎn)物加入量分別為5、10、20、40、80、160、240、320、400ng。時(shí)間對(duì)dNS3ATPase活性的影響:反應(yīng)體系(50μl)包括80ng酶純化產(chǎn)物、Tris-HCl(20mmol/L,pH7.0)、0.5mmol/LATP、2mmol/LMgCl2。反應(yīng)時(shí)間分別為5、10、20、30、40、50min。dNS3對(duì)不同NTP底物NTPase活性比較:反應(yīng)體系(50μl)包括80ng酶純化產(chǎn)物、Tris-HCl(20mmol/L,pH7.0)、0.5mmol/LNTP、2mmol/LMgCl2,室溫反應(yīng)20min。酶反應(yīng)底物分別為ATP、CTP、GTP、UTP。NS5對(duì)dNS3ATPase活性的促進(jìn)作用:NS5的表達(dá)純化參見文獻(xiàn)。NS5純化產(chǎn)物經(jīng)透析脫鹽,超濾濃縮,BCA法測(cè)定蛋白濃度。該反應(yīng)體系(50μl)包括dNS3純化酶產(chǎn)物1μg、NS5純化酶產(chǎn)物0.5μg、Tris-HCl(20mmol/L,pH7.0)、2mmol/LATP、2mmol/LMgCl2,室溫反應(yīng)20min。Poly(A)對(duì)dNS3ATPase活性的促進(jìn)作用:反應(yīng)體系(50μl)包括純化酶產(chǎn)物1μg、2μgpoly(A)、Tris-HCl(20mmol/L,pH7.0)、2mmol/LATP、2mmol/LMgCl2,室溫反應(yīng)20min。結(jié)果1.重組原核基因表達(dá)質(zhì)粒及酶切鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ、NcoⅠ雙酶切后,連入表達(dá)載體pET28a,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,在含卡那霉素的平板上選擇陽性克隆,PCR及HindⅢ、NcoⅠ酶切分析鑒定陽性克隆,獲得相應(yīng)大小的目的基因片段。重組原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pET28a-dNS3。圖1為NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域(160～618AA)基因和表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NS3的酶切鑒定電泳圖。將陽性克隆送上海生工生物有限公司測(cè)序,測(cè)序表明所克隆蛋白NTPase/RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域基因與GenBank中登革2型病毒D2-43株序列一致,未出現(xiàn)錯(cuò)義突變,酶切結(jié)果顯示插入正確。2.pet28a-ds3蛋白的表達(dá)攜帶有重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-dNS3的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為54×103的特異蛋白,大小與預(yù)期一致,且對(duì)照菌無此蛋白出現(xiàn)。圖2為pET28a-dNS3在誘導(dǎo)條件下與對(duì)照的全菌裂解液12%SDS分析。細(xì)菌裂解液上清與Ni-NTA樹脂混合后經(jīng)漂洗、洗脫,分步收集洗脫液,得到純度較高的dNS3蛋白。圖3為純化產(chǎn)物的SDS。3.免疫蛋白參與了de2c病毒的免疫反應(yīng)Westernblot(圖4)表明,表達(dá)的dNS3蛋白能夠與DEN2病毒免疫血清產(chǎn)生特異的抗原抗體反應(yīng),而對(duì)照菌裂解液反應(yīng)陰性。說明重組蛋白dNS3具有良好的抗原性,經(jīng)電泳變性后仍可與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。4.ds3蛋白的表達(dá)純化及其活性圖5為加終止液后dNS3ATPase活性反應(yīng)結(jié)果圖,可見加有dNS3的反應(yīng)孔與對(duì)照孔相比,呈明顯的陽性結(jié)果,表明表達(dá)純化所得的dNS3蛋白具有良好的ATPase活性。(1)ds3蛋白和atpase活性的關(guān)系A(chǔ)TPase活性的影響:圖6為酶量對(duì)dNS3ATPase活性的影響結(jié)果,可見dNS3蛋白含量與其ATPase活性呈現(xiàn)大致的劑量關(guān)系,在dNS3蛋白含量為80ng時(shí),對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測(cè)量較為合適。(2)應(yīng)時(shí)間對(duì)ds3ntpase活性的影響ATPase活性的影響:圖7為反應(yīng)時(shí)間對(duì)dNS3NTPase活性的影響結(jié)果,在反應(yīng)時(shí)間為20min時(shí),對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測(cè)量較為合適。(3)dens3活性對(duì)三磷酸呤核苷酸atp,gtp的影響圖8為dNS3對(duì)不同NTP底物NTPase活性比較結(jié)果,表明DEN2NS3的NTPase活性對(duì)三磷酸嘌呤核苷酸(ATP,GTP)有更強(qiáng)的底物親嗜性,其中ATP>GTP>UTP>CTP。(4)de2c非結(jié)構(gòu)蛋白ns3和ns5對(duì)ase活性的影響ATPase活性的促進(jìn)作用:圖9為NS5、poly(A)對(duì)dNS3ATPase活性的促進(jìn)作用柱形圖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NS5的加入能促進(jìn)dNS3ATPase活性,使其活性提高50%左右,此外,poly(A)對(duì)dNS3ATPase活性亦具促進(jìn)作用,可使dNS3ATPase活性提高2～3倍。登革病毒的復(fù)制和多聚蛋白的加工是相耦聯(lián)的過程,直接作用于病毒復(fù)制過程的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3已成為抗病毒藥物研究的重要靶標(biāo)。本研究在擴(kuò)增出NS3基因的基礎(chǔ)上,實(shí)現(xiàn)了NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域的克隆及可溶性表達(dá),并對(duì)其活性進(jìn)行初步研究。本研究表明DEN2NS3的NTPase活性對(duì)三磷酸嘌呤核苷酸(ATP,GTP)有更強(qiáng)的底物親嗜性,其中ATP>GTP>UTP>CTP,這與現(xiàn)有的其他型別登革病毒的NTPase活性的有關(guān)報(bào)道是一致的。雙鏈RNA的解旋需要ATP水解釋放能量;RNA解旋酶通常擁有促進(jìn)ATP或NTP水解的內(nèi)在活性,在RNA存在時(shí)水解NTP以提供RNA解旋所需能量。NS3與NS5(RNA依賴的RNA聚合酶)是登革病毒復(fù)制過程中兩個(gè)重要的蛋白,功能上具協(xié)同性,本室已構(gòu)建NS5的原核表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)了NS5的可溶性表達(dá)。蛋白質(zhì)分子間相互作用多為氫鍵及離子鍵,故離子強(qiáng)度對(duì)其相互作用影響較大,當(dāng)反應(yīng)液中的離子濃度達(dá)到100mmol/L時(shí),即觀察不到NS5對(duì)dNS3ATPase活性的促進(jìn)作用(結(jié)果未顯示)。通過純化產(chǎn)物透析脫鹽,超濾濃縮,降低酶貯存液中的離子濃度,反應(yīng)體系中離子濃度減至最小,在體外條件下證實(shí)了DEN2非結(jié)構(gòu)蛋白NS5對(duì)dNS3ATPase活性的促進(jìn)作用。提示在病毒復(fù)制時(shí),NS3與NS5間的相互作用可能對(duì)NS3的ATPase活性有調(diào)控作用,兩蛋白間的相互作用可能引起NS3活性位點(diǎn)的構(gòu)象變化,加強(qiáng)了與底物間的親和力,從而促進(jìn)了ATP的水解。本研究支持了Cui等人對(duì)DEN1型病毒NS5蛋白促進(jìn)NS3蛋白NTPase活性的見解,也為體外篩選能影響NS3與NS5相互作用的活性物質(zhì)提供了一個(gè)可選的高通量的篩選模型。Cui等人研究表明DEN1NS3的NTPase活性對(duì)三磷酸嘌呤核苷酸(ATP,GTP)有更強(qiáng)的底物親嗜性,但poly(U)及poly(A)的添加并沒有促進(jìn)其活性。而Li等人的研究表明poly(A)和poly(U)能極大地促進(jìn)DEN2病毒NS3的ATPase活性。本研究證實(shí)了poly(A)對(duì)DEN2病毒dNS3ATPase活性所具有的促進(jìn)作用,可使dNS3ATPase活性提高2～3倍。Poly(A)對(duì)dNS3ATPase活性的促進(jìn)作用,驗(yàn)證了dNS3對(duì)寡聚核苷酸的結(jié)合能力;同時(shí)也提示了DEN1型病毒NS3蛋白NTPase活性與DE