多拉菌素注射液含量測(cè)定中適用的固相萃取柱考察研究

多拉菌素注射液含量測(cè)定中適用的固相萃取柱考察研究劉少寧，李有志，王艷芬，李淑花，王燕，徐恩民基金項(xiàng)目：2015年國(guó)家科技支撐計(jì)劃基金項(xiàng)目：2015年國(guó)家科技支撐計(jì)劃“獸藥安全與質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)研究與應(yīng)用”編號(hào)“BAD11B03-01”作者簡(jiǎn)介：劉少寧，高級(jí)獸醫(yī)師，從事獸藥及畜產(chǎn)品質(zhì)量安全方面的檢測(cè)和科研工作。E-mail：liushaoning-6@163.com通訊作者：徐恩民。E-mail：xuenm@126.com(山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250022)[摘要]過(guò)于單薄。為完善多拉菌素注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)多拉菌素注射液含量測(cè)定中適用的固相萃取柱進(jìn)行了考察研究。采用C18色譜柱（5μm數(shù)字與英文單位之間空一格，全文核查修改。，150mm×4.6mm），以甲醇-乙腈-水（67：15：18）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫（流速為1.0mL/min），以檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，流速為1.0mL/min進(jìn)樣量20μL。經(jīng)線性、準(zhǔn)確度、精密度、耐用性和穩(wěn)定性試驗(yàn)考察后，結(jié)果表明表明：，該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，考察的固相萃取柱能用于多拉菌素注射液含量的測(cè)定。過(guò)于單薄。數(shù)字與英文單位之間空一格，全文核查修改。[關(guān)鍵詞]多拉菌素；含量測(cè)定；固相萃取柱StudyontheApplicationofSolidPhaseExtractionColumnintheContentDeterminationofDoramectinInjectionLIUShao-ning，LIYou-zhi，WANGYan-fen，LIShu-hua，Wang-yan，XUEn-min＊(ShandongInstituteofVeterinaryDrugQualityInspection，ShandongKeyLaboratoryforQualitySafetyMonitoringandRiskAssessmentofAminalProducts，ShandongJinan250022，China)Abstract：存有較多的語(yǔ)法錯(cuò)誤與不規(guī)范表達(dá)。Inordertoimprovethequalitystandardofdoramectininjection,thesolidphaseextractioncolumnsuitableforthedeterminationofdoramectininjectionwasinvestigated.AC18column(5μm,150mm×4.6mm)wasused,andamethanol-acetonitrile-water(67:15:18)mobilephasewasused,withadetectionwavelengthof245nm,andaflowrateof1.0mL/min.Theresultsshowthatthemethodisaccurate,simpleandrapid,andthesolidphaseextractioncolumncanbeusedtodeterminethecontentofdoramectininjection.ChromatographywasperformedonC18column(5μm,150mm×4.6mm),isocraticelutionwithmethanol-acetonitrile-water(67:15:18)asmobilephase(flowrate1.0mL/min).Thedetectionwavelengthwas245nm,Theinjectedvolumewas20μL.Afterlinearity,accuracy,precision,durabilityandstabilitytest,theresultsshowedthatthemethodisaccurate,simpleandrapid.Thesolidphaseextractioncolumncanbeusedtodeterminethecontentofdoramectininjection.存有較多的語(yǔ)法錯(cuò)誤與不規(guī)范表達(dá)。Keywords：Doramectin；contentdetermination；solidphaseextractioncolumn多拉菌素（Doramectin）是新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物，屬伊維菌素的衍生物。主要用于治療胃腸道蛔蟲，肺蠕蟲，眼絲蟲，虱和疥螨等引起的寄生蟲病[1,23]按順序依次標(biāo)注。。固相萃取技術(shù)（solidphaseextraction，SPE）是近年發(fā)展起來(lái)的一種樣品預(yù)處理技術(shù)，其原理是利用組分與吸附劑（固定相）間選擇性吸附與選擇性洗脫的過(guò)程，達(dá)到提取分離、凈化和富集的目的。當(dāng)應(yīng)用于性狀為油狀的獸藥產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)，其分離效果較好。多拉菌素注射液性狀為無(wú)色或微黃色的油狀液體，收載在2017版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)品卷，標(biāo)準(zhǔn)【含量測(cè)定】中標(biāo)注的LC-Si固相萃取柱（4.6×150mm，5μm）難以購(gòu)買，且不適合常用固相萃取裝置，給檢測(cè)單位和企業(yè)帶來(lái)麻煩。本研究依據(jù)現(xiàn)行的多拉菌素注射液標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)含量測(cè)定中適用的固相萃取柱進(jìn)行考察試驗(yàn)，完善了多拉菌素注射液含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)[32]。按順序依次標(biāo)注。1儀器與材料1.1儀器Agilent1260型高效液相色譜儀；WatersAllianceE2695型高效液相色譜儀；色譜柱AgilentZORBAXSB-C18（5μm，150mm×4.6mm）；電子天平（型號(hào)BT125D）購(gòu)自德國(guó)賽托里斯公司。1.2試藥與試劑多拉菌素對(duì)照品（批號(hào)為K0461411，標(biāo)識(shí)含量為95.6%）來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；多拉菌素注射液（批號(hào)：1812002規(guī)格：50mL：0.5g）來(lái)源于山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司；多拉菌素注射液（批號(hào)：1812001規(guī)格：100mL：1g）來(lái)源于齊魯動(dòng)物保健品有限公司；多拉菌素注射液（批號(hào)：PS185-1902001規(guī)格：50mL：0.5g）來(lái)源于艾美科?。ㄖ袊?guó)）生物醫(yī)藥有限公司；多拉菌素注射液（批號(hào)：D801SICN規(guī)格：50mL：0.5g）來(lái)源于施維雅（青島）生物制藥有限公司。固相萃取小柱SupelcleanTMLC-Si6mLl（500mg）SPETubes購(gòu)自美國(guó)Supelco公司；固相萃取小柱Sep-PakVac6cc（500mg）SilicaCartridges購(gòu)自美國(guó)Waters公司；甲醇為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；水為純化水，其余試劑均為分析純。2方法與結(jié)果2.1色譜條件流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（67：15：18）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)245nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。2.2溶液的制備2.2.1對(duì)照品溶液的制備取多拉菌素對(duì)照品10mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇70mL溶解，加水5mL，混勻，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻。2.2.2供試品溶液的制備精密量取1812002批樣品（50mL:0.5g）1mL至10mL容量瓶中，加二氯甲烷9mL稀釋制成每1mL中約含1mg的溶液，精密量取2.5mL，過(guò)LC-Si固相萃取柱（500mg/6mL），依次用正己烷6.25mL，二氯甲烷12.5mL，洗脫，棄去洗脫液，再用甲醇5mL洗脫，洗脫液收集于25mL量瓶中，加水1.25mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。2.2.3空白溶液的制備精密量取輔料溶液1mL至10mL容量瓶中，加二氯甲烷9mL定容。精密量取2.5mL，過(guò)LC-Si固相萃取柱（500mg/6mL），依次用正己烷6.25mL，二氯甲烷12.5mL，洗脫，棄去洗脫液，再用甲醇5mL洗脫，洗脫液收集于25mL量瓶中，加水1.25mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。2.3系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)精密量取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液各20μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果理論塔板數(shù)為6454，供試品溶液色譜圖中多拉菌素峰與對(duì)照品溶液色譜保留時(shí)間一致（圖1）。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性可以滿足檢測(cè)要求，供試品中其它成分對(duì)多拉菌素定量檢測(cè)無(wú)干擾，專屬性能滿足檢測(cè)要求。圖1專屬性試驗(yàn)色譜圖（A、B、C分別為多拉菌素對(duì)照品、魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)多拉菌素注射液供試品、魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)多拉菌素注射液輔料）Fig1HPLCchromatogramsofspecifictest2.4線性關(guān)系考察取多拉菌素對(duì)照品貯備液（濃度約1mg/mL），分別精密吸取適量，配制濃度約0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的系列溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=4E+07x+56549（R2＝1），結(jié)果表明進(jìn)樣濃度在0.01～0.8mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。2.5準(zhǔn)確度采用加標(biāo)回收的方法，在空白輔料溶液中，按工藝加入一定質(zhì)量的多拉菌素對(duì)照品，分別配制80%、100%、120%濃度的多拉菌素注射液，分別制備3份。按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率及RSD（結(jié)果見(jiàn)表1）。結(jié)果表明：在三個(gè)濃度水平下，多拉菌素注射液回收率為100.2%，符合注射液回收率98%~101%的范圍要求，證實(shí)了該方法具有良好的準(zhǔn)確度。表1回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab1Resultofrecoverytest樣品濃度實(shí)際添加(mg)理論測(cè)得(mg)回收率（%）平均值（%）RSD（%）80%-1200.18199.7799.79100.20.680%-2200.86202.62100.8780%-3200.61201.49100.44100%-1250.33248.6399.32100%-2251.67253.67100.80100%-3251.16250.2399.63120%-1300.23301.41100.39120%-2301.37303.19100.61120%-3301.21301.55100.112.6精密度2.6.1儀器精密度補(bǔ)充平均值。取2.2.1對(duì)照品溶液，精密量取20μL，按2.1色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得多拉菌素峰面積RSD為0.2%，表明儀器有良好的精密度。結(jié)果見(jiàn)表2。補(bǔ)充平均值。表2儀器精密度試驗(yàn)序號(hào)123456平均值峰面積4295277430397143109984306262431282543073544306114RSD（%）0.2/Tab2Resultofinstrumentprecisiontest2.6.2重復(fù)性取供試品（批號(hào)為1812002）注射液，按2.2.2方法配制6份樣品溶液，按2.1色譜條件，每份樣品進(jìn)樣2次，結(jié)果含量平均值為104.6%，RSD為0.9%。結(jié)果見(jiàn)表3。表3重復(fù)性試驗(yàn)Tab3Resultofrepeatabilitytest試驗(yàn)號(hào)123456平均值含量（%）104.7103.8104.1104.2104.7106.4104.6RSD（%）0.9/2.6.3中間精密度取供試品（批號(hào)為1812002）注射液，換由另一位操作者按2.2.2方法配制6份樣品溶液，選用WatersAllianceE2695液相色譜儀，WatersX-bridgeC18色譜柱按2.1色譜條件，每份樣品進(jìn)樣2次，結(jié)果含量平均值為103.8%，RSD為0.6%。結(jié)果見(jiàn)表4。表4中間精密度試驗(yàn)Tab4Resultofintermediateprecisiontest序號(hào)123456平均值含量（%）104.5104.3103.1103.3103.8103.6103.8RSD（%）0.6/2.7耐用性2.7.1不同品牌固相萃取小柱耐用性試驗(yàn)：取供試品溶液按照2.2.2方法考察市面上在售的兩款固相萃取小柱：①SupelcleanTMLC-Si6mL（500mg）SPETubes；②WatersSep-PakVac6cc（500mg）SilicaCartridges。測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，兩個(gè)廠家的固相萃取柱對(duì)含量測(cè)定的結(jié)果差異不顯著。市售的這兩款固相萃取柱均能滿足實(shí)驗(yàn)要求。表5不同固相萃取柱測(cè)定多拉菌素含量Tab5DeterminationofDoramectincontentbydifferentSPEcolumns固相萃取柱品牌編號(hào)樣品峰面積樣品峰面積平均值對(duì)照品峰面積對(duì)照品峰面積平均值含量（%）①439802743995644398795.5412862340580534093338104.2②439891743989064398911.5缺小標(biāo)題。方法耐用性試驗(yàn)：取1812002批樣品（50mL:0.5g），按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，將色譜條件微小變動(dòng)進(jìn)行測(cè)試，考察方法的耐用性。結(jié)果表明該方法能夠耐受不同色譜柱、柱溫、流速等因素的小范圍變化，測(cè)得多拉菌素注射液中多拉菌素的含量無(wú)明顯差異，說(shuō)明耐用性良好，結(jié)果見(jiàn)表6。缺小標(biāo)題。表6色譜條件微小變動(dòng)后的結(jié)果Tab6Resultsofminorchangesinchromatographicconditions條件結(jié)果(%)平均(%)RSD(%)AgilentZORBAXSB-C18104.7104.80.3WatersX-bridgeC18104.5InertsilODS-3105.1流速0.8mL/min105.0105.00.3流速1.0mL/min104.7流速1.2mL/min105.2柱溫33℃104.7105.20.3柱溫35℃105.0柱溫37℃105.82.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品（批號(hào)為1812002）的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，立即測(cè)定，再在2、4、8、12、16、20、24h的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)峰面積均與0小時(shí)比較，12小時(shí)內(nèi)相對(duì)偏差小于1%，結(jié)果提示樣品應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。展開(kāi)說(shuō)明原因。結(jié)果詳見(jiàn)表7。展開(kāi)說(shuō)明原因。表7穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab7Stabilitytest時(shí)間（h）峰面積與0小時(shí)比較相對(duì)偏差(%)04995717/249982030.04450114050.23850008690.081250559230.851651026611.502051566252.252451413872.042.9樣品含量測(cè)定取不同廠家的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL，上機(jī)測(cè)定峰面積，通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算多拉菌素的含量，含多拉菌素均在標(biāo)示量的90.0%～110%。結(jié)果見(jiàn)表8。表8不同廠家樣品測(cè)定結(jié)果Tab8Resultsofsamplesfromdifferentmanufacturers生產(chǎn)廠家批號(hào)規(guī)格含量（%）齊魯動(dòng)保1812001100mL：1g102.0魯抗舍里樂(lè)181200250mL：0.5g104.1艾美科健PS185-1902001100mL：1g100.8施維雅D801SICN50mL：0.5g100.63討論缺少與其它學(xué)者相關(guān)研究的具體對(duì)比與深入分析，深度欠佳。與結(jié)論缺少與其它學(xué)者相關(guān)研究的具體對(duì)比與深入分析，深度欠佳。3.1色譜條件的選擇與確定研究過(guò)程中對(duì)樣品的溶劑及色譜條件中流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流速進(jìn)行了嚴(yán)格的選擇性考察。研究表明，甲醇-乙腈-水（67：15：18）作為流動(dòng)相，1.0mL/min的流速在245nm波長(zhǎng)下色譜峰分離效果好，峰形較好[4-6]。3.2樣品前處理方法的選擇多拉菌素注射液性狀為無(wú)色或微黃色澄明油狀液體，是一類抗寄生蟲藥[7-9]。參考2017版《中華人民共和國(guó)獸藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2015年版化學(xué)品卷一部多拉菌素注射液含量測(cè)定項(xiàng)下前處理方法，本研究采用固相萃取小柱進(jìn)行樣品的前處理，降低了樣品的基質(zhì)背景，凈化和富集了目標(biāo)化合物，提高了樣品分析結(jié)果的可靠性和靈敏度[10,11]。結(jié)果證明該方法能夠較為完全地提取出多拉菌素注射液中的多拉菌素，并且方法的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性和耐用性均能達(dá)到檢測(cè)的要求[12，13-14]。3.3固相萃取小柱的選擇與啟示固相萃取技術(shù)與傳統(tǒng)的液液萃取法相比，可具有提高藥物回收率，能更加有效的將藥物與干擾組分分離等作用。商品化的固相萃取小柱（SPE柱）使得整個(gè)過(guò)程具有較高的重現(xiàn)性，能夠?qū)崿F(xiàn)多樣品的平行處理，大大提高檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)液體樣品溶液通過(guò)固相吸附層時(shí)，被測(cè)物被富集，再選用適當(dāng)強(qiáng)度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量溶劑迅速洗脫被測(cè)物質(zhì)，從而達(dá)到快速分離凈化與濃縮的目的。需要注意的是：在選擇固相萃取柱時(shí)，要考慮固相吸附層的吸附能力，避免實(shí)際操作時(shí)出現(xiàn)應(yīng)避免過(guò)載現(xiàn)象。SPE柱應(yīng)用于多拉菌素注射液等油性的含量測(cè)定取得了對(duì)于分離效果不好的獸藥產(chǎn)品時(shí)，能夠有效的將有效成分與雜質(zhì)進(jìn)行分離，并且重現(xiàn)性較高[14]。以往的研究中SPE柱多用于獸藥殘留的檢測(cè)，本試驗(yàn)對(duì)于其它分離效果不理想的獸藥產(chǎn)品的檢測(cè)提供了新的思路。3.34結(jié)論用高效液相色譜法測(cè)定多拉菌素注射液中多拉菌素的含量時(shí)，采用固相萃取小柱進(jìn)行前處理，方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，回收率高，可有效控制該制劑中多拉菌素的含量。參考文獻(xiàn)：中國(guó)獸藥典委員會(huì).《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部[S].ChinaVeterinaryPharmacopoeiaCommittee.People'sRepublicofChinaVeterinaryPharmacopoeiavolumeⅡ2015edition[S].中國(guó)獸藥典委員會(huì).獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).化學(xué)藥品卷2017年版[S].ChinaVeterinaryPharmacopoeiaCommittee.Veterinarydrugqualitystandard.ChemicalVolume.2017Edition[S].高玉紅，龐淑華，高玉閣，等.多拉菌素的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017，23：93-96.GaoYH，PangSH，GaoYG，etal.Researchprogressofdoramectin[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine，2017，23：93-96.[3]中國(guó)獸藥典委員會(huì).獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).化學(xué)藥品卷2017年版[S].ChinaVeterinaryPharmacopoeiaCommittee.Veterinarydrugqualitystandard.ChemicalVolume.2017Edition[S].[4]潘劍，陶云國(guó).陶瓷膜法提取多拉菌素的研究[J].中國(guó)抗生素雜志，2017，9：775-779.PanJ，TaoYG.Studyonextractionofdoramectinbyceramicmembrane[J].ChineseJournalofAntibiotics，2017，9：775-779.[5]GOKBULUTC,NOLANAM,MCKELLARQA.

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